Bevezetés

A ciklodextrinek gyártása elvileg két fázisból áll:

a) Az elôhidrolizált keményítô enzimes konverziója gyûrûs és nyílt láncú dextrinek keverékévé.
b) A ciklodextrinek izolálása a konverziós elegybôl, tisztításuk és kristályosításuk.

A ciklodextrinek (CD-k) gyártásának alapanyaga a keményítô. Minél tisztább a kiindulási keményítô, annál könnyebben biztosítható a végtermék nagyfokú tisztasága is. Az ideális a burgonyakeményítô lenne, de Magyarországon a kukoricakeményítôt használjuk, mert ez áll nagyobb mennyiségben és legolcsóbban rendelkezésre. Ennek az a hátránya, hogy jelentôs mennyiségû (közel 1%) zsírtartalma van, ami a ciklodextrinek egy részével oldhatatlan komplexet képez.

A nyílt láncú (lineáris amilóz, illetve elágazó szerkezetû amilopektin) keményítô-komponensekbôl a ciklodextrin-glükoziltranszferáz (CGT-áz) enzim hatására keletkeznek a gyûrûs szerkezetû ciklodextrinek. Ennek az enzimnek a forrása eredetileg a Bacillus macerans volt. Pár évvel ezelôtt még könnyen fel lehetett sorolni azt a néhány mikroorganizmust, amely ilyen enzimet tudott termelni, újabban azonban egyre több, pontosan nem is azonosított mikroorganizmusról írják le, hogy képesek ilyen enzimet termelni. A jövô minden valószínûség szerint a géntechnikával módosított mikroorganizmusok, illetve enzimek alkalmazása. Így pl. a patogén Klebsiella pneumoniae nagyon hatékony CGT-áz enzimet termel, de a Klebsiellá-val iparilag dolgozni veszélyes lenne. A megfelelô gént átvitték Bacillus subtilis-be, így most veszélytelenül, könnyedén termelhetô a szükséges enzim. Újabban évente átlag 2-3 új módosított enzimet írnak le, iparilag azonban ma még csak a Bacillus macerans és az alkalofil Baktérium N^o 38-2 eredetû CGT-áz enzimeket gyártják és alkalmazzák.

A CGT-áz enzim gyártása is két fázisból áll:

a) A ciklodextrin glükozil-transzferáz enzimet (CGT-áz enzim) termelô mikroorganizmus tenyésztése.
b) Az enzim izolálása a fermentlébôl, koncentrálása és tisztítása.

Az enzimgyártás tipikusan fermentációs technológiát igényel, így az rendszerint a ciklodextrinkonverziótól teljesen elkülönítve történik. (Magyarországon pl. az enzimet a Chinoin leányvállalata, a Biochin gyártja, a.ciklodextrin konverziót pedig a Gyôri Szeszgyár végzi a Chinoin technológiája alapján.) Az enzim termelésével a jelen munka nem foglalkozik.

Igen nagy számú közlemény és szabadalom foglalkozik a ciklodextringyártás fenti fázisaival. Egyes szabadalmak, illetve publikációk általában foglalkoznak a ciklodextringyártással, mások specifikusan a-CD, b-CD, vagy g-CD elôállításával.

A következôkben a ciklizáló enzimes konverziót kényszerûen megelôzô hidrolízist, a keletkezô a a-, b-, g-CD-ciklodextrinek közötti arány befolyásolását, valamint az egyes ciklodextrinek homogén állapotban történô elôállítását, majd az általánosítható megfigyeléseket, következtetéseket és további fejlesztések lehetséges irányait tárgyaljuk.

A keményítô elôhidrolízise

Keményítôt elôzetes hidrolízis nélkül csak 5%-ot meg nem haladó koncentrációban lehet alkalmazni a ciklodextrinnel történô konverzióhoz. 5% feletti keményítôtartalmú oldatok retrogradálni kezdenek, azaz a keményítôbôl hidrogénkötések létrejötte és konformációváltozása következtében oldhatatlan csapadék képzôdik, amely jelentôsen rontja a ciklodextrinkitermelést. Az elôhidrolízis a keményítô oldhatóságát, az oldat stabilitását jelentôsen fokozza és csökkenti a viszkozitást. A ciklodextrinkitermelés az elôhidrolízis mértékének függvényében maximumot mutat. A túlzott hidrolízis már ismét csökkenti a kitermelést. Könnyen elôállítható egy 45 g/100 ml-es koncentrációjú keményítô oldat, ha a keményítôt 10 dextróz ekvivalens értékig elôhidrolizáljuk; a 2 dextróz ekvivalens értékig hidrolizált keményítôbôl csak 20 g/100 ml koncentrációjú oldat állítható elô. Egy 5 dextróz ekvivalens értékig hidrolizált 11 súly% keményítôtartalmú oldatból triklóretilén hozzáadásával 34 ^oC-on a Bacillus macerans CGT-áz enzim hatására 58%-os konverzió érhetô el. Ugyanilyen körülmények között a 35 súly% keményítôtartalmú oldatból csak 35%-os kitermelés érhetô el. A 8% szárazanyag-tartalmat meghaladó kukoricakeményítô oldatból elfogadható ciklodextrinkitermelést csak akkor lehet elérni, ha az oldat viszkozitása nem haladja meg a 4000 cP értéket 70 ^oC-nál.

Az alfa-: béta-: gamma-ciklodextrin arány szabályozása a konverzió során

Az irodalomban gyakran lehet olvasni olyan törekvésekrôl, amelyek olyan enzimek elôállítását célozzák meg, amelyek csak a-, vagy csak b-, vagy csak g-ciklodextrint termelnek. Az ilyen törekvéseknek nincs meg a termodinamikai alapjuk. Az enzim ugyanis csak a biokatalizátor, amely a ciklizálási reakció egyensúlyának eléréséhez szükséges idôt rövidíti le. Az tény, hogy a különbözô eredetû enzimek különbôzô sebességgel termelik a különbözô ciklodextrineket és különbözô sebességekkel vezetnek el az egyensúlyi állapothoz és fgy valóban el lehet érni azt, hogy megfelelô enzimmel, megfelelô körülmények között zömmel csak egyik vagy másik ciklodextrin képzôdjék. Pl. a konverzió elsô óráiban a Bacillus macerans és a Klebsiella pneumoniae CGT-áz enzim fôként a-ciklodextrint termel, míg az alkalofil baktérium CGT-áz fôképpen b-ciklodextrint. Ha toluolt adunk a konverziós rendszerhez, akkor az a b-ciklodextrinnel oldhatatlan kristályos zárványkomplexet képez, a rendszerbôl kicsapódik, így a keletkezô a-ciklodextrint az enzim újra felnyitja és átalakítja b-ciklodextrinné. Ily módon a keletkezô ciklikus dextrineken belül a b-ciklodextrin több mint 90%-ban lesz jelen. Ha viszont a konverziót viszonylag hamar leállítjuk, akkor az izolált ciklikus dextrinek között zömmel a-ciklodextrin lesz megtalálható. 1-dekanol jelenlétében a konverzió viszont 35,9% a-CD-t és 3,7% b-CD-t eredményezett.

Jelenleg alkalmazott ipari körülmények között toluol jelenlétében a kukoricakeményítôbôl kb. 49% b- és 1% a-ciklodextrin keletkezik. A tisztítások és kristályosítás után a b-ciklodextrinre vonatkozott kitermelés átlagosan 33% körül van és ezeknek a termékeknek a tisztasága szárazanyagra vonatkoztatva jobb mint 99,7%. A termékben sem a-, sem g-ciklodextrin nem mutatható ki.

A konverzió mértékét jelentôsen befolyásolja az alkalmazott enzim mennyisége is. A konverzió során ugyanis az enzim folyamatosan inaktiválódik. Pl. a ciklodextrin-kitermelés egy 10,2 dextróz ekvivalensre elôhidrolizált 40 g/100 ml koncentrációjú keményítôbôl 45 ^oC-on 90 óra alatt a következô függést mutatta az enzimkoncentrációtól:

15 enzim egység/g keményítô 23,7% ciklodextrint
45 enzim egység/g keményítô 53,1% ciklodextrint
90 enzim egység/g keményítô 56,2% ciklodextrint eredményezett.

A konverziós idô megnyújtásával ezek a kitermelések még javíthatók, ennek viszont határt szab a gazdaságosság.

A béta-ciklodextrin konverzió technológiája

Ipari méretekben két eljárást alkalmaznak: komplexáló szer nélküli eljárást, amikor is a nem ciklikus dextrinekké konvertált keményítô dextrineket alkalmas enzimmel (glükamilázzal) lebontják könnyen eltávolítható, kis molekulájú cukrokká, vagy pedig komplexáló szert (pl. toluolt) alkalmazva a b-ciklodextrint folyamatosan eltávolítják a rendszerbôl. A két eljárástípus tehát nem csak a konverziós fázist tekintve, de a keletkezett ciklodextrinek izolálását tekintve is különbözik egymástól.

Tipikus oldószer nélküli technológia – melyet Japánban alkalmaznak – a következô. 15 súly% burgonyakeményítôt tartalmazó szuszpenzióhoz 10 mmol kalcium-kloridot adnak, ezt a Bacillus N^o 38-2 CGT-áz enzimjével 85-90 ^oC-on pH 8,5-nél elfolyósítják. Lehûtik 60-65 ^oC-ra, a pH-t kalcium-hidroxiddal beállítják 8,5-re, majd hozzáadják a teljes CGT-áz enzim mennyiségét. A konverziót 60 ^oC-nál állandó keverés mellett 30 órán át folytatják, majd az enzimet inaktiválják 100-120 ^oC-ra történô felhevítéssel. A reakcióelegy pH-ját 5,1-5,2-re beállitják és bakteriális eredetû alfa-amilázzal a nem ciklizált keményítôt, illetve dextrineket elhidrolizálják. Az oldathoz aktív szenet adnak, szûrik, majd ioncserélô gyantán átvezetve kb. 60 súly% koncentrációig vákuumban bepárolják és a hûlô oldatot oltókristályokkal keverik. A nyers b-ciklodextrint centrifugálják, mossák, majd átkristályosítják. A kitermelés 18-24%. A centrifugából kilépô oldat össz-szárazanyag tartalmának közel 20%-a a-, b- és g-ciklodextrin keverékébôl áll.

Tipikus oldószert alkalmazó technológia a következô. 33 súly% kukoricakeményítôt tartalmazó szuszpenzió pH-ját sósavval és kalcium-hidroxiddal 7,2-re állítják, majd Bacillus subtilis alfa-amilázzal 80 ^oC-on 10 perc alatt az optimális mértékû viszkozitásig hidrolizálják. Ezt követôen az enzimet 120 ^oC-ra történô hevítéssel (30 perc) inaktiválják és 50 ^oC-ra hûtik vissza a rendszert, majd hozzáadják a szûkséges CGT-áz enzimet. 30 perc után tovább hûtik 45 ^oC-ra, hozzáadnak 5 térfogatszázalék toluolt és intenzív keverés közben 105 órán át végzik a konverziót. A toluol b-ciklodextrin komplexet szûréssel izolálják, a komplexet mossák, majd vízzel felzagyolva vákuumbepárlóban a toluolt eltávolítják. Aktív szenet kevernek hozzá, szûrik és kristályosítják. Az eljárás hátránya, hogy ppm-es szinten toluol marad a termékben, elônye viszont a jobb kitermelés és az, hogy nyomokban sem tartalmaz kis molekulájú cukrokat. Ezek ugyanis a kémiai feldolgozás során (pl. származékok elôállítása) a termék sárgulását eredményezik.

Alfa-ciklodextrin elôállítása

Az a-ciklodextrin izolálása a komplexáló szert nem tartalmazó konverziós elegybôl szektív lecsapással vagy kromatográfiával lehetséges, de ipari termelés céljára túlságosan drága. Mivel az a-ciklodextrin vízoldékonysága közel 10-szerese a b-ciklodextrinének, a konverziós elegybôl kristályosítani gyakorlatilag nem lehet. Ezért célszerû az a-ciklodextrint is komplexáló szer jelenlétében elôállítani. Ilyen célra számos anyagot leírtak, pl. vajsavat, vagy vajsav sókat. Tapasztalataink szerint a dekanol a legalkalmasabb, amit könnyû vízgôzzel eltávolítani, továbbá élelmiszerekben 5 ppm-ig minden további nélkül engedélyezett adalékanyag. Az a-ciklodextrin oldékonysága vízzel telített dekanolban 40 ^oC-on csak a 6,5 mg/ml (dekanol nélkül már szobahôfokon 140 mg/ml körül van). A kitermelés alkalmas körülmények között könnyen eléri az 50%-ot. A dekanolkoncentráció növelése növeli a reakció sebességet is. A konverzió-elegyben a b- és a g-ciklodextrin mennyisége elhanyagolható. Metil-etil-keton és valamilyen anionos detergens, pl. nátrium-dodecil-szulfát, együttesen szintén alkalmas az a-ciklodextrin kitermelés fokozására, ez esetben az a-ciklodextrin azonban oldatban marad és a nem konvertált keményítôt, illetve az aciklikus dextrineket alfa-amilázzal kell elhidrolizálni, ezt követôen az a-ciklodextrin ciklohexánnal lecsapható. A keményítôre vonatkoztatva így is elérhetô 20-25%-os kitermelés.

Gamma-cikiodextrin elôállítása

A legnagyobb méretû gyûrû a g-ciklodextrin és ennek a legjobb az oldékonysága vízben. Egyes molekulák (pl. a szteroidok) komplexálására éppen a g-ciklodextrinre lenne szükség, de ezt a legnehezebb elôállítani. Részben termodinamikai okok miatt (a gyûrû nagymértékû flexibilitása) ez keletkezik legkisebb mennyiségben, másrészt a nagymértékû vízoldékonysága következtében (szobahômérsékleten már 230 mg/ml felett) a kitermelése általában gyenge. A g-ciklodextrin elôállításának egyik lehetôsége az, hogy a komplexképzô szert nem alkalmazó b-ciklodextrin gyártás anyalúgjából nyerik ki speciális ioncserélô mûgyanta oszlopokon történô frakcionált eluálással. Ily módon pl. 750 kg keményítô szárazanyagból 14 kg g-ciklodextrint lehet elôállítani, amelynek tisztasága jobb mint 98,5%.

Jobb kitermelés érhetô el, ha az elôhidrolizált keményítôt g-ciklodextrinre specifikus komplexáló szer, pl. metil-etil-keton és alfa-naftol keverékének jelenlétében konvertáljuk a CGT-áz enzimmel. Ez a két vendégmolekula ún. terner komplexet képez a g-ciklodextrinnel. Az oldhatatlan g-ciklodextrin metil-etil-keton+alfa-naftol komplexét metanolban szuszpendálják, így lehet eltávolítani az alfa-naftolt. A metanolos oldatot további ioncserélôs és aktívszenes tisztítás után bepárolják, majd vízbôl kristályosítva a keményítôre vonatkoztatva kb. 20% kitermeléssel nyerhetô a g-ciklodextrin. Leírtak olyan eljárást is, amelynél a komplexáló szer bróm-benzol, és ezt egyszerûen desztillálással lehet eltávolítani. A pentaciklikus terpenoidok (glycirrhizin) jelenléte is javítja a g-ciklodextrin kitermelést. A jelenleg legnagyobb sikerrel kecsegtetô eljárás a g-ciklodextrin ipari gyártására ciklohexadecenolt alkalmaz komplexálásra. Ez a mesterséges mósusz illatanyag, amely szerencsére nem toxikus.

Immobilizált CGT-áz enzim alkalmazása

A jövô kétségkívül az immobilizált, géntechnikával módosított, reakciótermékkel nem gátolt enzimet alkalmazó eljárásé. A CGT-áz enzim a szokásos módon immobilizálható szilárd polimer hordozókon vagy porózus üvegfelületen. A különbözô mikroorganizmusok által termelt CGT-áz enzimek sajátságai kismértékben különböznek ugyan egymástól, de általában az ipari szempontból kedvezô stabilitású enzimek közé tartoznak. Pl. a Bacillus macerans eredetû CGT-áz enzimet vízoldható karbodiimiddel aktiválva könnyen immobilizálható cellulóz- vagy dextrán-származékokon, illetve akrilsav- vagy akrilamid-kopolimereken. Az immobilizált enzim pH-optimuma 5,5 körül van, és a hômérsékleti optimum 40-60 ^oC között található, míg a szabad enzimnek egy viszonylag éles aktivitás csúcsa van 60 ^oC körül. Az enzim felezési ideje minden pH-értéknél és hômérsékletnél megjavult az immobilizálás következtében. Míg pl. az oldható enzim felezési ideje 70 ^oC-on, 5,9 pH-nál csak 1 perc, az immobilizált enzimé 24,3 perc.

Ipari ciklodextrin termelésben ma még nem alkalmaznak immobilizált enzimágyas reaktorokat. Természetesen ilyen esetben a feldolgozási technológiának is módosulnia kell. A kutatás irányai arra mutatnak, hogy a konverziós elegybôl specifikus komplexképzô adszorbensekkel kötik meg a megfelelô ciklodextrineket (más-más típusú immobilizált komplexképzô ágenset tartalmazó polimerek lesznek szükségesek az a-, a b-, illetve a g-ciklodextrinhez). Az ilyen adszorbensekrôl aztán a ciklodextrin egyszerûen vízzel eluálható, ily módon elkerülhetô lesz a szerves oldószerek alkalmazása.

"Elágazó" ciklodextrinek és egyéb ciklodextrin származékok

A ciklodextrinek gyártásánál – a keményítôben elôforduló alfa-1,6-elágazási pontok következtében mindenképpen keletkezik ún. "elágazó" ciklodextrin is. Ez azt jelenti, hogy a ciklodextrin-gyûrûn a primér hidroxilos oldalhoz alfa-1,6-kötéssel glükóz, maltóz, esetleg maltotrióz egység (vagy akár több egység) csatlakozik. Az ilyen ciklodextrinek csak tiszta állapotban lennének kristályosíthatók, de mivel általában több ilyen "elágazó" ciklodextrin is keletkezik, gyakorlatilag ezeket nem lehet kristályosítani. Vízoldékonyságuk sokkal nagyobb, mint az eredeti, nem szubsztituált ciklodextrineké. Ezeknek kémiai szintézissel történô elôállitása leírt, de ez gyakorlati célokra rendkívül drága lenne. Az elágazó kötéseket létrehozó pullulanáz enzim alkalmazásával ciklodextrinbôl és maltózból vagy glükózból elôállíthatók olyan keverékek, melyekben kb. 50% az elágazó ciklodextrinek aránya, a maradék pedig nem szubsztituált ciklodextrin. Ilyen terméket Japánban már gyártanak, mivel ezeknek jobb a vízoldékonysága és a glükózzal, illetve maltózzal történô szubsztitúció nem vethet fel semmilyen toxikológiai problémát.

...