Magyar Tudomány, 1998. szeptember

---

Hermecz István, Kánai Károly, Arányi Péter
Gyógyszerkutatás a Chinoinban

---

A közeledô ezredfordulót nemcsak politikailag, de gazdaságilag is jelentôsen átalakult viIág köszönti, elôre vetítve a 2000-es évek alig elképzelhetô minôségi változásait. A 20. század utolsó évtizedében a felgyorsult változások, az integrációs törekvések a nemzetközi gyógyszeripart sem kerülték el (1).

A nyolcvanas évek végéig közel egységes magyar gyógyszeripari válIalatok az egymástói független kettôs kihívás nyomán (a szocialista gazdasági rend és piac felbomlása, a gyógyszeripari óriások gyorsuló egyesülési törekvése) átalakultak. Jelenleg, többségükben multinacionális gyógyszervállalatok részeként mûködve, továbbra is a magyar gazdaság húzóágazatát alkotják, mind gazdasági, mind szellemi értelemben.

Az egyes gyógyszergyárak a kormányzati támogatást nélkülözõ belsô átalakulásuk során jelentôs erôfeszítéseket tettek a K+F tevékenységük megtartására (2). Ennek során mérlegelniük kellett, az anyavállalattal egyetértésben, hogy a K+F egység mûszerezettsége és felkészültsége minek felel meg leginkább: az új biológiai felismerések nyomán új hatásmechanizmuson alapuló innovatív gyógyszerek, vagy az ismert gyógyszerek hatékonyabb származékai kutatásának (ún. me-too kutatás) kutatásának, vagy a gyógyászatba már bevezetett hatóanyag(ok) új terápiás indikációban történô alkalmazásának, illetve az azonos hatásterületen elõnyösebb új gyógyszerforma kutatásának, vagy csak generikus változatai kifejlesztésének.

Közel egy évtizedes átalakulás során a megújult Chinoinban a kutatás meg tudta ôrizni aktivitását mind a felfedezô kutatás, mind a preklinikai fejlesztés és klinikai kutatás területén, szoros együttmûködésben a Sanofi anyavállalattal (3).

A megújuló kutatási gyakorlatot a prolil endopeptidáz enzim gátlószereinek kutatásán keresztül szemléltetjük. A felfedezô kutatás területén, követve a nemzetközi trendeket, az elsô vizsgálatokat jól definiált biológiai célponton enzim vagy receptor preparátumon, in vitro körülmények között végezzük.

A prolil endopeptidázt (PEP) 1971-ben említették elöször, mint az oxitocin ProLeu kötését hasító enzimet. A kutatások eredményeként ma már tudjuk, hopy az emlôs szervezetben szinte mindenütt jelenlévô enzim megtalálható mind a citoszolban, mind membránkötött formában. Legmagasabb koncentrációban a hippokampusban és cortexben fordul elô. A PEP a szerin proteázok egy sajátságos csoportját alkotja. A 710 aminosavat tartalmazó, monomer szerkezetû fehérje, a prolintartalmú, maximálisan 18 aminosavat tartalmazó oligopeptideket a prolin karboxiterminális végén hasítja.

A PEP endogén szubsztrátjai között számos prolintartalmú neuropeptidet és hormont találunk. Köztük például a thyreotrop-releasing hormont (TRH), substance P-t, vasopressin-arginint, amelyek fontos szerepet játszanak a tanulás és a memória javításában. A két utóbbi neuropeptid csökkent szintjét találták Alzheimer típusú betegségben szenvedôknél, amit igazolni látszik a szintén megfigyelhetõ megnövekedett PEP aktivitás. A TRH nemcsak a tanulási folyamatokban játszik fontos szerepet, de a kolinerg deficit eredményeként fellépô memóriazavarok cognitív impairment helyreállításában is. Ezek alapján feltételezhetõ, hogy egy hatékony PEP- gátló vegyület értékes farmakon lehet a tanulási folyamatok befolyásolásával a neurodegenerativ megbetegedések gyógyításában.

A téma indításánál irodalmi adatok alapján vezérmolekulaként az in vivo teszteken is hatékony SUAM-1221 jelû vegyület mellett döntöttünk. A molekulát három funkcionális régióra osztottuk és szisztematikusan vizsgáltuk szerepüket a hatékonyságra. A kutatás ezen fázisában a hatékonyság kvantitatív mérõszámaként kizárólag a PEP-aktivitás 50%-os gátlásához szükséges hatóanyagkoncentrációt, az ún. IC₅₀ értéket tekintettük. Az in vitro vizsgálatok elõtérbe kerülése a kísérletek és végsô soron a szerkezetoptimalizálás menetét gyorsítja, és jelentósen csökkenti a kísérleti állatok felhasználását.

Mivel a kutatás ezen fázisában már számos, eltérô heterociklusos végcsoportot tartalmazó, in vitro hatékony molekulát találtunk, ettõl a ponttól kezdve kutatásainkat több irányban folytattuk. Egyrészt foglalkoztunk a szerkezetoptimalizálással, azaz szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatával. Másrészt in vitro és in vivo módszerek beállításával modelleztük a hatékonyabb származékoknál várható felszívódási tulajdonságokat és a metabolitikus átalakulásokat. Különösen a központi idegrendszerre ható vegyületek esetén okoz nehézséget a betegséget modellezô in vivo állatkísérleti modell hiánya. A megnövekedett PEP-aktivitást mutató transzgenikus egereken folytatott vizsgálatok választ adhatnak erre a kérdésre, ezért együttmûködést kezdeményeztünk Bõsze Zsuzsával (Gödöllôi Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutató Központ) és Szabó Gáborral (Szegedi Biológiai Központ) kifejlesztésükre.

A szerkezet-hatás összefüggések tanulmányozására foglalkoztunk egy lehetséges farmakofor (a hatásért felelôs molekularész) modell felállításával. Ehhez molekulamechanikai számításokat végeztünk a hatásos és hatástalan vegyületek felhasználásával, ennek alapján sikerült egy hipotetikus farmakofor modellhez jutnunk. A továbbiakban már csak az így megfogalmazott követelményeket kielégítô molekulákat szintetizáltuk.
A háromdimenziós szerkezet-hatás összefüggések vizsgálatához CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) modell felállításával is foglalkoztunk, Lopata Antallal (CheMicro) együttmûködve. A munka során az egyes molekulákat a közös farmakofor alapján illesztettük. A molekulákat tanuló és validáló csoportba osztottuk, majd a tanuló csoportba sorolt vegyületeknél az egyes rácspontokban kiszámoltuk a szterikus és elektrosztatikus teret, ebbôl a parciális legkisebb négyzetek módszerével keresztvalidálással, illetve keresztvalidálás nélkül meghatároztuk a biológiai hatás és a szerkezet közötti összefüggést. Az egyenlet jóságát a validálási csoportba sorolt vegyületek hatásbecslésén keresztül mértük fel, azaz a becsült értéket egybevetettük a mért értékkel. Kielégítô mérték esetén elkészítettük a CoMFA kontúrábrát. A térképszerû ábrán a különbözô sûrûségpontok kijelölik a molekula továbbépítésére szterikusan kedvezményezett, illetve ellenjavallt térrészeket. Hasonló információk nyerhetôk az elektronszívó, illetve elektronküldô csoportok kiépítésének elônyôs helyeirôl.

Részben ezek alapján, változtatásokat terveztünk a molekulák szerkezetében, a pirrolidin-, a prolingyûrûben, az összekötõ láncon és magán a heterociklusos végcsoporton. A számos lehetõség közül ezúttal a pirrolidin- és prolingyûrükben végrehajtott változtatásokat említjük, amikor a pirrolidingyûrû hármas helyzetében kénatomot tartalmazó vegyületek bevitelével a tulajdonságait vizsgáltuk. A kénatom bevitelével megváltozik pl. a gyûrû geometriája, mivel a C-S kötés hosszabb, mint C-C kötés hossza, valamint a kötésszög is eltér. Változás állhat be a molekula metabolitikus stabilitásban is, hiszen a kénatom szulfoxiddá, ill. szulfonná oxidálódhat, amelyek eredményeként a vegyületek vízoldhatósága is változik.

A jelzett átalakításokat elvégeztük a prolingyûrû 3-as helyzetében is, és jelentôs különbséget találtunk a pirrolidin- illetve prolingyûrûk módosításával nyert molekulák biológiai aktivitásában. A kénatom beépítése a prolingyûrûbe biológiai hatás gyengüléséhez vezetett, amelyet az oxidációs fok növelése kompenzált. Ezzel ellentétes hatást figyelhettünk meg a pirrolidingyûrû hasonIó módosítása során elõállított vegyületek esetében.
A molekulatervezés leghatékonyabb módszere az adott enzim, vagy receptorból elôállított egykristály, illetve az inhibitorral együttkristályosításával nyert egykristályok térszerkezetének meghatározása röntgendiffrakciós módszer segítségével. Ezért elhatároztuk a prolil endopeptidáz eddig nem ismert 3D térszerkezetének feltérképezését. A Fülöp Vilmos (University of Oxford), Polgár LászLó [MTA Enzimológiai Intézet) és Böcskei Zsolt (Chinoin) együttmûködésével végzett munkát Hajdú János (University of Uppsala) segítette. A munka fôbb fázisaiban az elsô lépés a fehérje izolálása és tisztítása, amelyet a kristályosítás sok türelmet igénylô feladata követ. A kristály minôsége nagyon fontos a további munka szempontjából, növelve a sikeres megoldás valószínûségét (a fehérjekristályok kb. 90%-a víz). Ezután következik a röntgensugárzás vagy szinkrotronsugárzás alkalmazásával a diffrakciós adatgyûjtés. Ezt részben a franciaországi ESRF, a német DESY és az angliai Daresbury szinkrotronokban végeztük. Az ún. fázisbecslés sikeres elvégzése után, amely a legnehezebb lépés, és erre számos eljárás ismert, következhet a szerkezet finomítása, azaz kibontakozik elôttünk az enzim 3D szerkezete. A közel hároméves erôfeszítéseket végül siker koronázta. Ez az elsô eset, hogy egy sajátos enzimcsalád elsô tagjának térszerkezetét csak magyar, ill. magyar származású kutatókból álló csoport oldotta meg (4).

A disznóizomból izolált PEP szerkezete mellett Náray-Szabó Gáborral (ELTE TTK Elméleti Kémiai Tanszék) együttmûködve meghatároztuk több inhibitorral képzett kompIex szerkezetét. Az enzim aktív centrumához kötõdô prolinál rész az alkilláncon át egy üreghez vezet, ahol a heterociklusos végcsoport helyezkedik el. A fehérjekrisztallográfiai adatok igazolták munkahipotézisünket a fenilcsoport helyettesítését térkitöltô heterociklusokkal, hiszen ezek részére egy meglehetôsen tágas, vízzel kitöltött üreg áll rendelkezésre az enzimben. A heterociklusok egyes pozícióiba hidrogénakceptor, illetve hidrogéndonor szubsztituenseket elhelyezve növelni tudtuk az inhibitor és enzim közötti másodlagos kölcsönhatások számát. A vizsgálati eredmények birtokában lehetôségünk van a szerkezet további finomítására, így in vitro még hatékonyabb gátlószerek tervezésére és szintézisére. Az eredmények alapján megújult szintetikus munka
 gyümölcseként ma már 10^–10 mól koncentrációban, in vitro hatékony származékokkal rendelkezünk (5).

A fejlesztésre alkalmas gyógyszerjelölt kiválasztásához a hatékonyság mellett a molekula egyéb tulajdonságait is optimalizálni kell. Az in vivo körülmények között várható felszívódási tulajdonságok becslésére szövettenyésztésbôl származó humán sejtvonalat alkalmazunk. A további vizsgálatokból kízártuk az azonos szerkezeti sorba tartozó molekulák közül azokat, amelyeknél kedvezôtlenebb feszívódás várható.

A vegyületek metabolikus viselkedésének vizsgálatára több lehetôség is kínálkozik. Vizsgálataink során patkány, ill. humán májhomogenizátumot alkalmazva meghatározzuk azt az idôt, amely alatt az adott vegyület 50%-a metabolizálódott. Szerencsésnek mondhatjuk, hogy a vegyületek túlnyomó része nagyobb stabilitást mutat a humán májhomogenizátummal szemben, mint patkány májhomogenizátum esetén. A metabolikusan kevésbé stabil vegyületeket ugyancsak kizárjuk a további vizsgálatokból.

Ex vivo vizsgálatokkal igazoltuk, hogy több származék esetén is intraperitoniális, ill. orális adagolás után patkányok agyhomogenizátumában jelentôsen csökkent a PEP-aktivitás. Hasonlóan ígéretes eredményeket tapasztaltunk farmakológia teszteken is. Például az úgynevezett szociális viselkedés teszten jelentôs memóriafokozó tulajdonságot tapasztaltunk több vegyületnél, még 1 mg/testsúly kg dózisnál is, orális adagolást követôen.

Összefogtalva elmondhatjuk, hogy az irodalmi vezérmolekula szerkezetének többirányú változtatásával jelentôs in vivo hatást mutató molekulacsaládokat fejlesztettünk ki. Bízunk benne, hogy a megismert szerkezet-hatás összefüggések ismeretében a biológiai tulajdonságok többirányú optimalizálásával (hatékonyság, szelektivitás, felszívódási tulajdonságok, metabolikus stabilitás) eljuthatunk egy gyógyszerjelölt molekulához, amely a témaindításnál megfogalmazott elvárásokat klinikai vizsgálatok során igazolja.

Fontosnak tartjuk azt is, hogy e munka során lehetôségünk nyílt különbözô kutatóintézetekben dolgozó, kiváló hazai kutatókkal történô újszerû együttmûkôdés kialakítására is. Meggyôzödésünk ugyanis, hogy a gyógyszeripari alkalmazott kutatás és a biológiai-kémiai alapkutatás hosszú távú eredményessége szorosan összefügg.

HIVATKOZÁSOK
1. Hermecz István: Gyógyszerkutatás az alapoktól a kockázati tõkéig. a) Lombik és Reaktor, 1998. 3-9. o., b) Magyar Kémikusok Lapja nyomdában.
2. Hermecz István: A gyógyszerkutatás helyzete Magyarországon. Magyar Kémikusok Lapja. 1994. 49. kötet. 361-364. o.
3. Arányi Péter: Új gyógyszerkutatási stratégia a Chinoinban. Magyar Kémikusok Lapja. 1995. 50. kötet, 290-293. o.
4. Fülöp Vilmos, Böcskei ZsoIt, Polgár Lász(ó: Prolyl Oligopeptidase: an Unusual beta-Propeller Domain Regulates Proteolysis. Cell. (megjelenés alatt).
5. Kánai Károly, Erdõ Sándor, Szappanos Andrea, Bence Judit, Hermecz István, Szvoboda Györgyné, Bátori Sándor, Héja Gergely, Balogh Mária, Horváth Ágnes, Sipos Judit, Bartáné Bodor Veronika. Párkányi Zsolt, Lokics Viktor, Molnár Péter: Preparation of proline pyrolidine amide derivatives as prolylendopeptidase inhibitors. PCT Int. Appl. WO 07,116 (1997).