Magyar Tudomány, 1999. február

---

Ötvös László
A génrendszer ôrzôangyala
A p53 tumorszuppresszor szerkezet-hatás összefüggéseinek tanulmányozása a Wistar intézetben

---

A p53 jelû fehérjét sokan úgy tekintik, mint a génrendszer ôrzô-védô angyalát. A p53 népszerûségét jelzi, hogy a Science magazin 1993-ban az Év Molekulájának választotta. A szintén p53-nak nevezett gén egy sejtmagban található foszfoproteint kódol, amely fehérje irányítja a sejtek válaszát a DNS megsérülése esetén. Amikor a p53 által szabályozott ellenôrzô mechanizmus mûködik, a DNS megsérülése a sejt szaporodási ciklusának megállását, vagy a programozott sejthalált (apoptózis) eredményezi. Az emberi rákos megbetegedések több mint felében ez a p53 által szabályzott ellenôrzô mechanizmus inaktiválva van, aminek valószínûleg a p53 fehérjén ilyen esetekben található pontmutációk az okozói.

***

Napjainkban a p53-mal foglalkozni fölöttébb divatos dolog. A Current Contents heti cikkszemléi 50–60 p53-mal foglalkozó közleményt listáznak és p53 fedõnéven mintha grantot is könnyebb lenne szerezni, mint egyéb molekulával. Mostanra már az elmondottakból nyilvánvalóvá válhatott, hogy a Wistar intézet, mint az amerikai rákkutatás egyik fellegvára, megkülönböztetett érdeklôdést mutat a p53-mal kapcsolatos genetikai, biokémiai, immunológiai és szerkezeti kémiai kutatások iránt. A futball világbajnokság után talán megbocsátható a hasonlat, hogy a p53 csapatban az intézet szinte minden laboratóriuma helyet kap ilyen vagy olyan módon. A három középpályás, akiknek a p53 a fô kutatási területe, és a többieket is bele akarják vonni a játékba, Hitdegund Ertl, Thanos HaIazonetis és jómagam. A következõkben a hármunk e témába vágó munkáját foglalom össze. Mint ki fog derülni, mindhárman ugyanannak a kérdéskörnek különbözô ágazatait vlzsgáljuk, gyakran szorosan együttmûkôdve.
 

Molekuláris mechanizmus

A p53 mutációjával összefüggô daganatos megbetegedésekben a sejtek nem halnak el, ha DNS-t károsító anyagokat juttatunk be a szervezetbe, és ily módon a hagyományos besugárzásos vagy kemoterápiás szerek a betegség kezelésére alkalmatlannak bizonyulnak. Halazonetis kutatásainak középpontjában az a kérdés áll, hogy mi az a molekuláris mechanizmus, amelyen keresztül a sikeres rákterápiában használatos DNS-károsító szerek aktiválják a nem mutálódott "wild-type" p53-at. Halazonetis arra is választ keres, hogy a p53 hogyan fejti ki egy, a DNS-szint szabályozásától független funkcióját, ami a transzkripció folyamatában játszik szerepet.

A DNS megsérülése megemeli a p53 szintet a sejtekben, ezzel aktiválva a fehérjét. A megemelkedatt p53 szint pedig jelentôsen megnöveli a p53 DNS-hez való kötôdési affinitását. Halazonetis azokat a tényezôket szeretné azonosítani, amelyek a p53 szintjének emelkedését okozzák. A p53 meghatározott DNS-szekvenciákhoz kötõdik, a molekula specifikus DNS-kötô középsô régióján keresztül. Ugyanakkor a p53 C-terminális, erôsen bázikus szakasza is köt DNS-t, ez a kapcsolat azonban a DNS szekvenciájától gyakorlatilag teljesen független.
Halazonetis feltételezte, hogy a DNS megsérülése úgy növeli meg a p53-nak a DNS-hez való affinitását, hogy tulajdonképpen nem a specifikus DNS-kötô központi fragmensre hat, hanem a C-terminális, a DNS szekvenciájától független fehérjedarabon idéz elô változásokat. Ilyen változás lehet például a p53 foszforilezettségi állapotának a módosítása. Valóban, ha egyedi aminosav mutációk befolyásolják a p53 funkcióit, a változások a foszforilezettségi szintben valószínûleg ugyanolyan méretû, vagy méginkább észlelhetô funkcióbeli módosulásokkal járhatnak. A fehérjén legalább 16 potenciális foszfátakceptor szerin és treonin található. Ugyan minden fehérjerégió képviselteti magát, a dologban az az izgalmas, hogy a potenciális foszforilezési helyek nincsenek egyenletesen elosztva, hanem a foszfátakceptor aminosavak száma jelentôsen megemelkedett az N-terminális és a C-terminális fehérjeszakaszokon. Éppen ezek a fehérjeszakaszok azok, amelyek szerepet játszanak a p53-at érintô biológiai folyamatokban. A már említett C-terminális DNS-kötô fragmens mellett az N-terminális fehérjerész a felelôs a p53-nak a transzkripcióban játszott szerepéért, valószínûleg a TATA-kötô fehérjével történô kölcsönhatásán keresztül. Visszatérve Halazonetis munkájához, azt találták, hogy amíg a nem besugárzott sejtekben mind a Ser376 és a Ser378 egyaránt foszforilezve van, addig ionizáló besugárzás hatására a Ser376-ról a foszfátcsoport eltávozik. Ez a defoszforilezett p53 variáns kölcsönhat a 14-3-3 jelû fehérjecsoporttal, amely a jelátvitelben játszik szerepet foszfoszerin tartalmú fehérjékhez való kötödésén keresztül. A p53-14-3-3 kölcsönhatás megnöveli a p53-nek a DNS-hez való szekvencia-specifikus kötôdését. Ily módon meg lehet magyarázni, hogy az ionizáló besugárzás hogyan aktiválja a p53-at.

A p53 fehérje magnövekedett élettartama szintén befolyásolja azt a folyamatot, amelyen keresztüi a DNS károsodása megemeli a p53 szintet. Amikor a DNS épségben van, a p53 gyorsan degradálódik, mert ilyenkor a p53 N-terminális szakasza kötödik az Mdm2 nevû, sejtmagban található fehérjéhez. Az Mdm2-vel való kapcsolat a p53 bomlásához vezet. A DNS károsodása esetén azonban a p53 leválik az Mdm2-rõl, és ez a folyamat megemeli a p53 élettartamát. Halazonetis és munkatársai azt találták, hogy a DNS károsodása a p53 N-terminálisán egy foszforilezõdési folyamatot indít el, ami leválasztja a p53-at az Mdm2-rôl. A foszforilezendô szerin kicserélése egy nem foszforilezhetô aminosavra megakadályozza a p53 szint emelkedését a DNS károsodását követõen. Mindez azt bizonyítja, hogy a p53 N-terminálisának foszforilezôdése egy fiziológiailag is számottevô folyamat lehet.
 

Immunterápiás lehetôségek

Ertl a p53 fehérjével kapcsolatos alapvetô immunológiai folyamatokat és immunterápiás lehetôségeket vizsgálja. A vakcinia virus DNS-ébe épített normális vagy mutáns p53 DNS-szekvenciák segítségével a fehérje különbözô variánsai állíthatók elô a természetesnél sokkal nagyobb mennyiségben. Ertl rákos egérsejteket tanulmányozott és azt találta, hogy azok az átlagosnál jóval több p53-at termelnek. Így automatikusan született az ötlet, hogy esetleg a p53-at gyártó vakciniavírus rekombinánssal immunizálva lehetséges olyan immunválaszt nyerni, amely megvéd a rákos tünetek kialakulásával szemben. Valóban, amikor egereket oltottak be a p53-vakciniavírus rekombinánssal és az egereket meg akarták fertôzni olyan rákos sejtvonalakkal, amelyek fokozott mennyiségben termeltek p53-t, az egerek 30-50 százalékos védettségi szintet mutattak a fertôzéssel szemben. Még ha az egerek egy része meg is betegedett, a beteg állatokban a tumor kifejlôdése lényegesen lelassult. Egy glioma sejtvonallal szembeni védekezésben mind a citotoxikus, mind a segítô T-sejtek szerepet játszottak, csakúgy, mint a természetes ölõ (NK) sejtek. Érdekes módon, a Th2 típusú segítô T-sejtekre jellemzô citokinek jelenléte fontosabbnak tûnt, mint a Thl típusúaké. Azok az egerek, amelyek ellenálltak kis mennyiségben alkalmazott rákos sejtekkel való megfertôzési kísérletnek, olyan védettségi szintet értek el, hogy késôbb teljesen ellenállóak lettek nagymennyiségû sejttel való fertôzés ellen is. Mivel a p53 egy olyan fehérje, amely mindenkiben megtalálható, Ertl megvizsgálta, hogy a p53-mal immunizált egerekben kifejlôdik-e autoimmunitás. Ilyen jellegû negatív reakciót viszont nem talált. Az egerek máj- vese-, és csontvelômûkôdése teljesen normálisnak tûnt. A Wistar intézetben felismert citokin, az interleukin 12 adagolása tovább növelte az immunizálás hatékonyságát olyannyira, hogy egy olyan összetett terápia, amelyikben mind a p53-mal való immunizálás, mind az interleukin 12 bejuttatása helyet kapott, sikeresen csökkentette a már kialakult tumoros elváltozások mértékét. Ezek a kutatások azért rendkívül érdekesek elméletileg, mert azt mutatják, hogy egy mindenkiben elôforduló fehérje az immunológiai védelem alapjául szolgálhat olyan esetekben, amikor ez a fehérje rákos megbetegedésekben hatványozottan termelôdik. Ennek valószínûleg az a magyarázata, hogy az indukált immuneffektor folyamatok szelektíven felismerik a p53-at túltermelõ tumoros sejteket, és nem érintik azokat a normális sejteket, amelyekben csak kis mennyiségû, a sejtmagban koncentrált p53 fordul elô.
Egy másik immunterápiás lehetôség a rákos megbetegedésekben elôforduló p53 mutációs pontok ellen irányulhat. Ertl azt is vizsgálja, hogy vajon a rákkal fertôzött egerekben termelôdnek-e T-sejtek az aminosav mutációs helyek ellen. Ha ilyen immunodomináns mutációt találnánk, ez alapjául szolgálhatna egy T-sejt bázisú vakcina kifejlesztésének. Ezekben a kutatásokban én is részt veszek a teszt peptidek szintézisével. Hét olyan peptidet állítottunk elô, amelyek vagy domináns, vagy szubdomináns mutációs epitópok lehetnek. A peptidek tesztelése ennek a cikknek a megírásakor folyamatban van.
 

Új módszerek szintetikus peptidek felhasználásával

Ertllel való együttmûködésem és a szintetikus peptidek el is vezetnek a saját p53-mal kapcsolatos kutatásaimhoz. Mint azt már korábban említettem, azt tudjuk, hogy a p53 egy többszörösen foszforilezett fehérje, de hogy valójában a feltételezett egyenkénti foszforilezôdési helyeken található-e foszfátcsoport, és hogy egészséges és rákos sejtekben a foszforilezôdések helye és mértéke azonos-e, arról egyelõre fogalmunk sincsen. Más kutatócsoportok ezt a problémát úgy vizsgálják, hogy a p53-at termelô rekombináns sejtvonalakban a foszfátakceptor szerineket és treoninokat nem foszforilezhetô aminosavakra (pl. alaninra) cserélik, vagy a feltételezett foszfoaminosavakat glutaminsavval helyettesítik, és a fehérje különbözô biológiai funkcióit vizsgálják. Egy alternatív stratégia szerint radioaktív foszfort építenek be a p53 molekulába, és tripszines emésztés után a foszfopeptideket analizálják kétdimenziós gélelektroforézissel. Ezek a módszerek azonban sok bizonytalan tényezôt hordoznak magukban.

Nemrégiben az SV3T3 jelû fibroblaszt sejtekben termelt egér p53 fehérje emésztése után 6, az azt megelõzôen még nem ismert foszfopeptidet mutattak ki. Amikor azonban a fehérje N-terminális 154 aminosavas szegmensét vizsgálták, a potenciális triptikus fragmensek közül egy sem felelt meg a 6 új foszfopeptid elektroforetikus mozgékonyságának. Ezek után valószínü, hogy a foszfopeptidek a központilag helyet foglaló szekvencia-specifikus DNS-kötô szegmensbõl származnak. Igen ám, de a központilag elhelyezkedô szerinek és treoninok in vivo csak részlegesen, sok esetben csak nagyon alacsony mértékben vannak foszforilezve, és a jelzett foszfopeptidek azonosítása igen bonyolult feladat lehet. Másodsorban, ha ezek a foszfopeptidek valóban a központi DNS-kötô szegmensbôl származnak, azonosításuk egyes szerinek vagy treoninok mutációja után szinte lehetetlen, mivel ilyen jellegû mutációk az egész fehérjét érintô konformációs változásokat idézhetnek eló. Például annak a patkány p53-ból származó szerinnek, amelyik a humán p53-ban a Ser315-nek felel meg, alaninra való helyettesítése után egy négy aminosavval hátrébb található, különben foszforilezhetõ szerin foszforilezhetetlenné válik (ennek a szerinnek a sorszáma humán pozícióra nem fordítható le, ugyanis ez a humán szekvenciából hiányzik). Még ha egy specifikus szerin foszforilezôdése elõ is segíti valamely p53 funkció elvégzését, ugyanazon szerin mutációja egyáltalán nem biztos, hogy az adott funkció megsemmisülését vonja maga után. Az elmondottak tisztán érzékeltetik, hogy új módszerekre van szükség a p53 egyes aminosavai foszforilezettségi szintjének megállapítására, és a foszforilezôdés egyes biológiai konzekvenciáinak tanulmányozására.

Mi ezeket az új módszereket a szintetikus foszfopeptidek felhasználásával igyekszünk kifejleszteni. A foszforilezési helyek azonosítására foszfátspecifikus monoklonális ellenanyagokat kiválóan Iehetne alkalmazni, de ilyen reagensek egyelôre nincsenek forgalomban. Mintegy elsô próbálkozásként, elôállítottuk a humán p53 C-terminális 23 aminosavas fragmensét, amelyben mind a Ser378, a protein kináz C (PKC) szubsztrát aminosav, mind a Ser392, a kazein kináz II (CKII) szubsztrát aminosav foszforilezve volt. A foszfopeptid szintézisét folytattuk egy a molekulát megtörô tripeptid fragmenssel, és a 31 D jelû, 15 aminosavból álló segítô T-sejt epitóppal. A teljes 41 aminosavas kétszeresen foszforilezett peptid tisztítása, és tömegspektrometriás jellemzése után egereket immunizáltunk vele. A lépsejteknek mielomasejtekkel való fúziója után nagyszámú monoklonális ellenanyagot kaptunk. Az ellenanyagok foszfátspecificitását és érzékenységét alaposan megvizsgálva a p53-18 jelût váiasztottuk ki további feldolgozásra.

Enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálat (ELISA) alapján a p53-18 csak azt a p53 fehérje variánst ismerte fel, amelyet bakulovírussal fertôzött rovarsejtekben termeltünk, de azt nem, amelyet baktériumokban állítottunk elô. A bakulovírussal fertôzôtt rovarsejtekben termelt p53-at a p53-18 ellenanyaggal készült immunaffinitási oszlopon homogénre lehetett tisztítani. A tisztított fehérjét tripszines emésztésnek vetettük alá, a kapott fragmenseket folyadékkromatográfiával szétválasztottuk, és tömegspektrometriával analizáltuk. Bebizonyítottuk, hogy a tisztított fehérjében mind a PKC, mind a CKII szubsztrát szerin valóban foszforilezve volt. Ezzel ellentétben a baktériumokban termelt p53 foszforilezettségi szintje jóval alacsonyabb, mivel ezekbôl a rendszerekbôl az eukariotikus kinázok általában hiányoznak. A p53-18 jelû ellenanyag foszfátspecificitását mutatja, hogy nem kötôdik a kevésbé foszforilezett baktériumban termelt fehérjevariánshoz. A szintetikus peptideket tanulmányozva, az ellenanyag foszfátspecificitása még inkább meggyôzô képet nyújt. A p53-18 csak a kétszeresen foszforilezett 23 aminosavas peptidet ismerte fel, de egyáltalán nem ismerte fel a nem foszforilezett vagy a csak egyszeresen foszforilezett peptideket. Érdekes módon, a nem foszforilezett peptid is felismerhetôvé vált, amikor az antigént trifluor-etanolban oldottuk fel, és így szárítottuk rá az ELISA lemezre. Mint azt egy független konformációs analízis alapján tudjuk, a trifluor-etanol egy helikális szerkezetet indukál a p53 C-terminálisán. A peptid szerkezetének helikális kerék formátumú ábrázolásakor a két foszforilezendô szerin, a Ser378 és a Ser392 igen közel kerülnek egymáshoz, és valószínûleg az ellenanyag ezt a szerkezetet ismeri fel. Ezt a hipotézist támasztja alá az a tény, hogy a 14 aminosavnyi távolság, ami a két foszfoszerin között van, általában túlságosan nagy ahhoz, hogy lineáris antigének esetén az ellenanyagok számára egyidejûleg felismerhetô legyen (az epitópok hossza a legtöbb esetben 6–12 aminosav közé esik). Valószínû, hogy a konformációs egyensúlyhoz a foszfopeptid (és az egész fehérje foszforilezett C-terminális szakasza) hozzájárul helikális konformerekkel is.

A p53-18 jelû ellenanyag, amely hamarosan kereskedelmi forgalomban is hozzáférhetôvé válik, ez idô szerint az egyetlen foszfátspecifikus p53 ellenes monoklonális ellenanyag, és úgy tûnik, hogy egy párját ritkítóan hasznos reagens kis mennyiségû p53 fehérje kimutatására, és a fehérje C-terminálisa foszforilezettségi szintjének jellemzésére.

A p53 fehérje foszforilezett C-terminálisának immunodomináns voltát bizonyítja az a tény is, hogy rákos betegek vérsavója a kétszeresen foszforilezett peptidet lényegesen jobban ismerte fel, mint a nem foszforilezett vagy az egyszeresen foszforilezett peptideket. A p53 tumoros megbetegedésekben megemelkedett szintje anti-p53 ellenanyagok termelését indítja el, de úgy tûnik, hogy a fehérje foszforilezett változata immunogénebb, mint a nem foszforilezett variáns. Egy esetleges alternatív lehetôség az, hogy a tumoros megbetegedésekben a foszforilezettségi szint megemelkedik, és ez magyarázza meg a vérsavó foszfátspecificitását. Ez utóbbi feltételezés azonban nem valószínû DNS-kötôdési vizsgálataink alapján. Mint azt már említettem, a C-terminálissal kapcsolatos nem specifikus DNS-kötõdés mintegy negatív szabályozóként mûködik a fehérje középponti szakaszával összefüggésbe hozható szekvencia-specifikus DNS-kötôdéssel szemben.

Mi azt is vizsgáltuk, hogy a PKC és a CHII szubsztrát szerinek foszforilezôdése hogyan befolyásolja a nem specifikus DNS-kötôdést. Ehhez 33 aminosavból álló peptideket állítottunk elô nem foszforilezve, egyszeresen foszforilezve, és kétszeresen foszforilezve. Pozitív kontrollként a teljes p53 fehérjét használtuk. A kötôdés szintjének mérésére egy viszonylag új eljárást, a fluoreszcenciás polarimetriát alkalmaztuk. Ennek az az alapja, hogy ha valamilyen anyag kötôdik egy oldatban található, fluorogént tartalmazó másik anyaghoz, a fluoreszceint hordozó anyag forgási sebessége lelassul, és a mért anizotrópia arányos a kötôdés erôsségével. Két oligonukleotidot szintetizáltunk, melyeknek a végére fluoreszceint kapcsoltunk. Mind a p53 fehérje, mind a szintetikus peptidek kötôdtek mindkét jelzett oligonukleotidhoz. A peptid foszforilezése akár a Ser378-on, akár a Ser392-n számottevôen gyengítette a DNS-kötôdést. A kétszeres foszforilezés a kötôdéshez szükséges peptidkoncentráció ötszörös megnövelését tette szükségessé. Ez azt feltételezi, hogy a negatív szabályozás kevésbé számottevô, ha a fehérje C-terminálisa többszörösen foszforilezve van. Ez a következtetés összhangban van egy korábbi észrevétellel is. Ha foszforilezéssel eltávolitjuk a 421 jelû poliklonális ellenanyag (amelyik a Ser378 környékén ismeri fel a nem foszforilezett fehérjét) epitópját, akkor a p53 leállítja a sejtnövekedést, szintén azt sugallva, hogy normális állapotban a fehérje C-terminálisa erôsen foszforilezett állapotban kell legyen.

Cirkuláris dikroizmus és mágneses magrezonancia spektroszkópiás vízsgálatokkal kimutattuk, hogy a Ser378 foszforilezése jelentôs konformációs változásokat eredményez mind a foszfoaminosav közvetlen környezetében, mind egy hosszú távú hatás révén a CKII szubsztrát hely körül is. Ennek azért van jelentôsége, mert a C-terminális bázikus fragmens igen közel fekszik a tetramerizálódási folyamatban részt vevô fehérje fragmenshez, és a másodlagos szerkezet változása, különösen, hogyha az hosszabb távra is elhat, szerepet játszhat a biológiailag aktív tetramer szerkezet kialakulásában. Maga a tetramerizálódó fragmens is tartalmaz egy foszforilezhetô szerint (Ser315). Következô célunk a Ser315 foszfátcsoport hatásának vizsgálata a tetramerizálódó fehérjeszakasz konformációjára. Ugyancsak vizsgálni fogjuk, hogy az N-terminális szerinek foszforilezôdése hogyan befolyásolja a TATA-kötô fehérjével való kapcsolatot. Ennek céljából olyan komplex 42 aminosavas peptideket kell készítenûnk, amelyek 2-szeresen, 3-szorosan, vagy még inkább 5-szörösen vannak foszforilezve (az N-terminálist foszforilezô kinázok szubsztrát aminosavain), plusz egy további fluoreszceincsoportot hordoznak. Ennek a kivételes szintetikus feladatnak a napokban vágtunk neki.