Magyar Tudomány, 2000. november

---

Demeter Ádám
Az NMR-spektroszkópia alkalmazási lehetôségei a gyógyszertervezésben

Edward M. Purcell¹ és Felix Bloch² vezette azokat a történeImi jelentôségû kísérleteket 1946-ban, ameIyek a mágneses magrezonancia (NMR) spektroszkópia megszületéséhez vezettek. Az NMR-spektroszkópia alig több mint ötvenéves múltja alatt bekövetkezett bámulatos fejlôdés egyetlen spektroszkópiai technikával sem állítható párhuzamba. Az elmúlt ötven év bebizonyította, hogy az NMR-spektroszkópia a molekulák szerkezetének és a molekuláris kölcsönhatások vizsgálatának rendkívül hatékony és sokoldalúan alkalmazható kutatási eszköze. Folyamatosan bôvülô fizikai, kémiai, biológiai és orvosi alkatmazásaival az NMR-technika napjainkra önálló, multidiszciplináris tudománnyá vált: számtalan szakkönyv és tudományos folyóirat foglalkozik az NMR elméletével és gyakorlati alkalmazásaival; legatább nyolc fizikai és két kémiai Nobel-díjat adományoztak olyan kutatóknak, akik munkája különbözô mértékben kapcsolódik a mágneses magrezonancia jelenségéhez.³
Az NMR-spektroszkópia már hosszú ideje a gyógyszeripari kutatások egyik kiemelten fontos eszköze. Történelmi okokból fakadóan elsôdleges szerepe a kémiailag szintetizált kis szerves vegyületek vagy különféle természetes forrásokból izolált molekulák, metabolitok azonosítása és szerkezetének jellemzése. Az NMR hagyományos gyógyszeripari alkalmazása elsôsorban a szintetikus kémiai kutatómunkát, valamint a szennyezésprofil-vizsgálatokat és a metabolitkutatást támogatja. Az elmúlt néhány évtizedben végbemenõ forradalmi, technológiai és módszertani fejlôdésnek köszönhetôen az NMR-spektroszkópia gyógyszeripari alkalmazási köre jelentôsen kibôvült. Egyre több olyan külföldi gyógyszeripari példáról olvashatunk, ahol az NMR-spektroszkópiát más gyógyszertervezési eszközökkeI karöltve sikeresen alkalmazzák egy racionálisabb gyógyszerfejlesztés folyamatában. Az NMR-spektroszkópiával meghatározható szerkezeti, dinamikai és egyéb kémiai-biológiai szempontból hasznos információk a szerkezet-hatás összefüggés megértését elôsegítve, jelentôs hatást gyakorolhatnak a gyógyszerkutatás-fejlesztés irányára. A jelen összefoglaló tanulmány kitekintést kívánt nyújtani azokra az NMR-spektroszkópiában rejlô potenciális lehetôségekre és módszerekre, melyek elsôsorban gyógyszertervezési szempontból a hazai gyógyszerkutatásban meghonosításra érdemesek. A jelen közlemény alapjául külföldi összefogIaló tanulmányok szolgáltak.⁴

^***

NMR a gyógyszerkutatásban

A 20. század végét jellemzõ, egyre gyorsuló tudományos és technikai fejlõdésnek köszönhetõen a gyógyszeripari kutatás és fejlesztés (K+F) alapvetõ stratégiai változásokon ment keresztül. A multinacionális gyógyszervállalatok átalakult K+F stratégiája egyértelmûen kijelöli a 21. század gyógyszerkutatásának irányát. Ezt az utat olyan technológiák kifejlõdése és térhódítása fémjelzi, mint például a kombinatorikus kémia, a nagy áteresztõképességû in vitro biológiai tesztelés (HTS, High-Throughput Screening), és a racionális gyógyszertervezés. Az új technológiák és kutatási stratégiák meghonosítására, anyagi kereteik között, a hazai gyógyszergyárak is törekednek, aminek sikeres példáját mutatja a Chinoin prolil endopeptidáz enzim inhibitorok fejlesztése a racionális gyógyszertervezés eszköztárának felhasználásával.⁵

Ahhoz, hogy az NMR nyújtotta lehetõségeket el tudjuk helyezni az új típusú gyógyszerkutatási stratégiákban, vázlatosan át kell tekintenünk a gyógyszerfejlesztési folyamatot. Az 1. ábra a korszerû gyógyszerfejlesztés-tervezés ciklikus folyamatának egy nagyon leegyszerûsített sémáját, valamint azokat a kapcsolódási pontokat mutatja, ahol az NMR potenciálisan hasznos információkat képes szolgáltatni.

1. ábra. Az NMR-spektroszkópia kapcsolódása a gyógyszerfejlesztés folyamatához

A korszerû gyógyszerkutatás felfedezõ szakaszában a "minél többet, minél gyorsabban" elvét alkalmazzuk: lehetõleg kombinatorikus kémiai szintézisekkel létrehozott vegyülettárakból in vitro HTS-teszteken kiválasztjuk azokat a célzott biológiai hatású vezérmolekulákat, amelyek a gyógyszerfejlesztés kiindulópontjául szolgálnak. A gyógyszerkutatás következõ tervezési fázisában a "minél jobbat, minél okosabban" elve érvényesül. A szerkezet-hatás összefüggés felderítésén keresztül, számítógépes molekulatervezés segítségével, a vezérvegyületek szerkezeti, fizikai-kémiai paramétereinek finom változtatásával, optimalizálásával jutunk el egy olyan ígéretes gyógyszerjelöltig, amely már részletes in vivo tesztelésre kerülhet, és gyógyszerré fejieszthetô. A kombinatorikus kémia és a HTS lehetõvé teszik a gyógyszerfejlesztés kezdeti szakaszának felgyorsítását, míg a számítógépes molekulatervezés eszközei a szerkezet-hatás összefüggés megértését mozdítják elô. Az 1. ábra azt illusztrálja, hogy az NMR a gyógyszerfejlesztés kezdeti felfedezési, és azt követô tervezési stádiumában, valamint az in vivo tesztelés fázisában is képes integráltan részt venni, és hasznos információkkal szolgálni.

A gyógyszerfejlesztési folyamat szempontjából alapvetôen az NMR-kísérletek három csoportját lehet megkülönböztetni:

a) A kis molekulák NMR-je általában a gyógyszeriparban tipikusan elôforduló kisebb molekulatömegû (1 kDa ³ molekulatömeg) szerves vegyületek szerkezetvizsgálatát jelenti. Ez tehát az NMR hagyományos gyógyszeripari alkalmazási területe, mely elsõsorban a szintetikus kémiai munkát támogatja a K+F különbözô stádiumaiban, de egyre nagyobb szerepet kap a minôségbiztosításban is.

b) A makromolekuláris NMR lehetõvé teszi biopolimerek, elsõsorban fehérjék és nukleinsavak, illetve ezek egymással és kisebb szerves és szervetlen vegyületekkel alkotott komplexeinek vizsgálatát. A makromolekuláris NMR-rel meghatározható információk a felfedezési stádiumban az in vitro tesztelést, míg a tervezési fázisban a szerkezet-hatás összefüggés megértését mozdítják elô.

c) Az in vivo NMR lehetõséget teremt a gyógyszerjelölt hatásának in vivo vizsgálatára szöveteken, célszerveken, élô állatokon és emberen, ami a metabolitkutatásban, illetve a gyógyszerfejlesztés végsõ klinikai stádiumaiban szolgál hasznos információkkal.

Az összefoglaló tanulmány fókuszpontjában a gyógyszertervezési szempontból legfontosabb makromolekuláris NMR módszerei állnak. Ez a terület a hazai NMR-mûszerparkkal és mûszertechnikai hátérrel elérhetõ, illetve a jövõben egyre inkább elérhetôvé válik. Az NMR hagyományos, analitikai jellegû gyógyszeripari alkalmazásait (lásd molekulák szerkezetvizsgálata) nem tárgyaljuk. A rendkívül dinamikusan fejlõdõ in vivo NMR gyógyszerfejlesztési vonatkozásait csak röviden érintjük.

Receptoralapú gyógyszertervezés
A makromolekuláris NMR-rel meghatározható információk hatékonyan alkalmazhatók a gyógyszerkutatási stratégiákban egyre fontosabb szerephez jutó ún. szerkezet-, vagy receptoralapú gyógyszertervezésben.

A receptoralapú gyógyszertervezés kiindulópontja a biológiai célmolekula (fehérje, nukleinsav) azonosítása, elôállítása és tisztítása szerkezetkutatási célokra. Amennyiben a biológiai célmolekulát sikerül NMR-spektroszkópiai vagy röntgenkrisztallográfiai vizsgálatokra alkalmas formában elõállítani, és térszerkezetét meghatározni, úgy lehetõvé válik a vezérmolekulák szerkezet-, vagy receptoralapú optimalizálása. Ennek során meghatározzuk a preparatív biokémiai tesztek alapján kiválasztott vezérmolekula receptorral alkotott komplexének térszerkezetét. A receptor és a ligandum bioaktív konformációjának ismeretében, a molekuláris felismerésért felelôs kölcsönhatások megértésével lehetõség nyílik a ligandum szerkezetalapú optimalizálására, olyan analógok tervezésére, amelyek várhatóan nagyobb affinitásúak. Az optimatizált ligandumot szintetikusan elõállítjuk, majd biológiai tesztelés után a ciklust addig folytatjuk, míg további affinitásnövekedést már nem tudunk elérni.

A makromolekuláris NMR a receptoralapú gyógyszertervezés folyamatába három ponton képes aktívan bekapcsolódni:

– egyik kapcsolódási pont a szabad biológiai célmolekula térszerkezetének meghatározása,
– a másik pont a receptor-ligandum komplex szerkezeti és egyéb vizsgálata,
– a harmadik kapcsolódási pont a vezérmolekulák azonosítása.

A továbbiakban a biológiai szempontból talán legfontosabb célmolekulák, a fehérjék, illetve fehérje-ligandum komplexek vizsgálatára fogunk szorítkozni.
 

Makromolekuláris NMR

Mindenekelôtt tekintsük át azokat az erõforrásokat, amelyek megléte a makromolekuláris NMR mûvelésének alapfeltétele (2. ábra).

2. ábra. Fehérjék NMR-rel történô meghatározásának feltételei

 A makromolekulásis (fehérje) NMR alapvetôen három terület szimbiózisán alapszik:
a) Az egyik terület a biotechnotógia, ami lehetõvé teszi fehérjék nagy mennyiségû elôállítását (génszintézis, mutáció, klónozás, expresszió), tisztítását, szelektív, vagy teljes izotópjelzését (¹³C, ¹⁵N, ²H) NMR szerkezetkutatási célokra.
b) Az NMR-spektroszkópia, amely képes makromolekulák szerkezeti és dinamikai paramétereinek meghatározására. (A fehérjék térszerkezetének NMR-rel történô meghatározása nagyszámú, atomok közötti távolságok és torziós szögek meghatározásán alapszik. Ezeket az atomi távolság és torziós szög adatokat a fehérjeszerkezet számításakor mint a fehérje szerkezetét definiáló ún. kényszerfeltételeket használjuk.)
c) Harmadrészt a számítástechnika, ezen belül olyan spektrális adatfeldolgozási és molekulamodellezési módszerek, amelyek lehetõvé teszik az NMR-rel kísérletileg meghatározott spektrumokból molekulaszerkezeti információk meghatározását, illetve ezeket felhaszálva, a makromolekula, illetve a makromolekula-ligandum komplex térszerkezetének atomi szintû leírását, számítását (szerkezetszámítás).
A három technológia együttesen képes arra, hogy oldatfázisban a fehérjék háromdimenziós térszerkezetét meghatározza kb. 10 kDa molekulatömegig iztópjelzés nélkül, 10–15 kDa között minimum ¹⁵N izotópjelzést alkalmazva, 15 kDa fölött ¹³C és ¹⁵N izotópjelzéssel (25–30 kDa környékén már deutériumjelzés is szükséges). Az elmúlt egy-két évben kezdenek kifejlôdni azok a technikák, amelyek a proteinek szerkezetmeghatározásának felsô hátárát kb. 100 kDa molekulatömegig képesek felvinni.⁶ Napjainkra az NMR-spektroszkópia a röntgenkrisztallográfiával összemérhetõ felbontással képes a biopolimerek térszerkezetének atomi szintû leírására. (A makromolekulák szilárd fázisban történõ vizsgálatának metodikai fejlesztése jelentôs erõvel folyik, és nagy fejlõdés elôtt áll különösképpen a membránproteinek tekintetében.)

A makromolekuláris NMR-rel kapcsolatban meg kell említeni gyógyszeripari szempontból alapvetõen fontos két tényezôt: a vizsgálatok költség- és idõvonzatát. A fehérjék géntechnológiai úton történô elôállítása fejiett biotechnológiai hátteret igényel. A szerkezetkutatásra alkalmas fehérje elõállítása, a megfelelõ expressziós rendszer kifejlesztése és az izotópjelzés költséges mûveletek. Egy NMR-mérésre alkalmas, izotópjelzéssel ellátott minta elõállítási költségét 1000 USD-ben mérjük. Ezt a mintát egy dedikált kutatócsoport kimondottan erre a célra fenntartott készüléken, melynek értéke felszereltségtôl függõen több 100 mFt, több hónapig méri folyamatosan. A szerkezetvizsgálat NMR-es alapfeltétele a korszerû NMR-es mûszertechnika és méréstechnika. Ez minimum 500 MHz-es többcsatornás készülék, a megfelelõ izotópok (¹H, ²H, ¹³C, ¹⁵N) mérésére alkalmas mérôfejek, gradiens egység, hullámforma generátor stb. meglétét, másrészt naprakész, az adott egyedi készülékre adaptált méréstechnikát, speciális pulzusszekvenciák implementálását jelenti. Ezen erôforrások megléte esetén ideális esetben a vizsgált fehérje térszerkezetét, a fehérje méretétôl, tulajdonságaitól függõen szerencsés esetben fél, de inkább minimum egy év alatt lehet meghatározni. A szerkezetszámításhoz szintén több tízmillió Ft nagyságrendû szakértõi szoftverre és hardverre (adatfeldolgozás + molekulamodellezés, munkaállomás) van szükség. Ezek az adatok és tények látszólag nehezen egyeztethetôek össze a gyógyszeripari kutatást meghatározó idôbeli és financiális határokkal. Mégis a jelentôsebb külföldi gyógyszervállalatok saját makromolekuláris NMR-apparátust mûködtetnek. A makromolekuláris NMR ugyanis nem csak néhány akadémiai intézetben mûvelt alapkutatási tevékenység, hanem napjainkban már bevett protokollok alapján mûködõ, "rutin" eljárássá vált, amely, mint technológia know-how, a jelentõsebb külfoldi gyógyszergyárak K+F tevékenységének szerves részét képezi.

Egyre inkább érvényesül az a tendencia, hogy a gyógyszeripari kutatások ismert szerkezetû biológiai célmolekulákhoz köthetô hatásmechanizmusokat céloznak meg. Nyilvánvalóan egy új, addig ismeretlen biológiai célmolekula izolálása és szerkezetmeghatározása, a szerkezet-hatás összefüggés és hatásmechanizmus megállapítása jelentôs elônyökkel jár az originális gyógyszerkutatásban. A makromolekuláris NMR-laboratóriumok azonban csak részben foglalkoznak új biólógiai célmolekulák szerkezetmeghatározásával. Gyógyszerkutatási szempontból legalább ennyire, vagy még inkább fontos a már akadémiai kutatásból, vagy más egyéb forrásból ismert térszerkezetû biopolimerekhez történõ ligandumkötõdés vizsgálata. Protein- és NMR-adatbankokban számos receptor szerkezeti és NMR-paraméterei hozzáférhetôek, mely a ligandumkötódés-vizsgálatok kiindulási pontjául szolgálhatnak.

Hazai viszonylatban ezeknek az erõforrásoknak egy része rendelkezésre áll. Például a Richter Gedeon Rt.-ben üzemelô Varian gyártmányú, 500 MHz-es NMR-mûszer már jelenlegi felszereltsége mellett is képes izotóp által jelzett fehérjék mérésére, továbbá az NMR-mérések kiértékelését, és a szerkezetszámítást lehetõvé tévõ mindkét vezetô molekulamodellezô és NMR-spektrumértékelõ szoftvercsomag (MSI, TRIPOS) megtalálható. Az irodalomból ismert fehérjék expressziójára kifejlesztett törzsek megvásárolhatóak, új törzsek kifejlesztése pedig célszerûen külsõ kutatás keretében finanszírozható lehet. Így gyakorlatilag csak fermentációra és fehérje tisztítására van szükség, ami már gyógyszergyári apparátussal is megoldható.
 

Makromolekuláris NMR-információk

... A kötôdés tényének igazolására bármilyen NMR-rel mérhetõ molekuláris paraméter, pl. kémiai eltolódás, jelszélesség, T₁ és T₂ relaxációs idõ, nukleáris Overhauser-effektus (NOE), diffúziós állandó stb. megváltozása szolgálhat. Amikor a kis molekulatömegû ligandum hozzákötõdik a nagy mólsúlyú makromolekulához, akkor azok a fizikai paraméterek fogják jellemezni, mint a makromolekulát, ezért a jelszélesség megnõ, a T₂ relaxációs idõ lecsökken, a NOE-effektus elõjelet vált (+ –> –), a diffúziós állandó lecsökken. Attól függôen, hogy a ligandum kis affinitással (K_d > 10^–5), vagy nagy affinitással (K_d  < 10^–8) kötõdik a fehérjéhez, eltérõ képet kapunk az NMR-spektrumban, ezért eltérõ stratégiát kell alkalmazni a kötõdés vizsgálatánál. Kis affinitású ligandumok esetében a szabad és kötött forma (az NMR-mérés ideje alatt) gyorsan egymásba alakul, így az NMR-spektrumban a két állapot átlagát mutató jelet detektálunk, míg nagy affinitás esetében a két forma jelei elkülönülnek.

Kötôdésvizsgálatok lehetõvé teszik a makromolekula-ligandum komplex disszociációs egyensúlyi állandójának
és a disszociáció sebességének meghatározását, amibôl a kötôdés erôsségére, a makromolekula-ligandum komplex stabilitására következtethetünk. Ezek a kvantitatív információk felhasználhatóak pl. QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) számításoknál. A disszociációs állandó meghatározására protokollok léteznek, amelyek szerint a ligandum koncentrációjának függvényében felvett titrálási görbék analízisével határozzák meg a K_d-értéket, legáltalánosabban a kémiai eltolódás és jelszélesség változását figyelve.⁷

A kombinatorikus kémia és HTS technológiájával kapcsolatban felmerülõ nagyon izgalmas és rendkívül aktuális kérdés a vegyülettárak, keverékek "dekonvolúciója". A gyószerkutatás felfedezõ szakaszában a "minél többet, minél gyorsabban" elve szerint a vezérmolekulák kiválasztására egy HTS-teszten egyszerre több komponens keverékét is vizsgálhatjuk (pl. kombinatorikus kémiai keverék szintézissel létrehozott vegyülettárat). Amennyiben a HTS-teszt pozitív választ ad, alapvetõ kérdést jelent, hogyan határozzuk meg, hogy a vizsgált keverék melyik komponense felelõs a hatásért. Elõfordulhat, hogy a HTS-en kapott pozitív válasz tulajdonképpen fals pozitív, ami a komponenskeverék egészétôl származik. A keveréket alkotó komponenseket külön-külön vizsgálva az aktivitás elvész.

Több NMR-es technika is létezik, amely lehetõvé teszi keverékekbôl az aktív komponens kiszûrését, szerkezetének azonosítását anélkül, hogy a keveréket fizikailag komponenseire kellene szétválasztanunk, ami jelentôs idômegtakarítást jelent. Ezek a módszerek kis affinitású ligandumok esetében alkalmazhatóak, tehát kimondottan a vezérvegyületk azonosítására alkalmasak. Az affinitás alapján történõ szûrésre a relaxációs idôk és a diffúziós állandó, és a NOE elôjelének megváltozását használják.⁸ Az Abott cég például eljárás-szabadalommal védi az általuk kifejlesztett NMR-es technikát.⁹ Ezek a módszerek a feleslegben lévô ligandumok jeleit, illetve azok változását mérik, tehát nem igényelnek köItséges izotópjelzett fehérjét.

Alapvetõen fontos kérdés a kötõdés helyének meghatározása, hiszen erre a HTS általában nem ad választ. Az NMR viszonylag gyors és hatékony módszert nyújt ennek a kérdésnek a megválaszolására. A fehérjék amid jeleinek kémiai eltolódása nagyon érzékeny indikátora a kötõdésnek. A ligandumkötôdés hatására a kötõdés lokális környezetében lévô amid jelek kémiai eltolódása megváltozik, ami a fehérje szerkezetének és a spektrum asszignációjának ismeretében közvetlen információt ad a kötõdés helyérôl. Ennek az effektusnak a mérésére szolgál egy igen érzékeny és gyors mérés, az ún. kétdimenziós ¹H-¹⁵N HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) kísérlet, amely ¹⁵N-jelzett fehérjék amid jeleinek vizsgálatát teszi lehetõvé. A receptor kötõhelyének feltérképezésére ugyancsak felhasználható az amid hidrogén-deutérium kicserélôdés sebességének megváltozása.

A másik izgalmas témakör a térszerkezet vizsgálata, ami egyrészt a makromolekula és ligandum bioaktív konformációjának meghatározását, a kötõdésért felelõs funkciós csoportok azonosítását, az egyes csoportok ionizációs állapotának vizsgálatát, valamint a vegyület oldószerrel érintkezõ felületének meghatározását jelenti.
A szerkezet-hatás összefüggés analízise során ezek az információk rendkívüli értéket képviselnek, és nagymértékben elõsegíthetik a molekuláris hasonlóságon alapuló analógok megtervezését.

A ligandum bioaktiv konformációját, kis affinitású ligandumnál ún. NOE transzfer vizsgálatokkal állapíthatjuk meg,¹⁰ míg nagy affinitású ligandumok esetében ún. izotóp szerkesztett és izotóp szûrt méréseket¹¹ használhatunk a ligandum és receptor jeleinek megkülönböztetésére és a konformáció vizsgálatára.

A fehérje és ligandum egyes funkciós csoportjainak ionizációs állapota fontos információ lehet az enzimmechanizmus és a molekuláris felismerés megértésében. A pK_a-érték, a tautomer formák meghatározása jó példája annak, hogyan egészítheti ki és bõvítheti az NMR a pusztán geometriai információkat.

Gyógyszertervezési szempontból hasznos megkülönböztetni a vezérmolekula oldószerrel érintkezô felületét, mely vélhetôen kevésbé fontos szerepet játszik a receptor felismerésben, és azokat a régiókat, amelyek a receptor affinitásért és specificitásért felelõsek. Az oldószerrel érintkezõ felületeken olyan kémiai módosításokat hajthatunk végre, amelyek a gyógyszerjelölt oldhatóságát, biológiai hasznosíthatóságát, farmakokinetikáját és toxicitási tulajdonságait javíthatják. Az oldószerrel érintkezô, illetve kötésben részt vevô felületek megállapítására relaxációs reagenseket (pl. HyTEMPO) használhatunk.

A harmadik témakör a dinamikai vizsgálatok. Ez az a pont, ahol az NMR a röntgenkrisztallográfia pusztán szerkezeti információján alapvetôen túlmutat. Az oldatfázisban megvalósuló különbözõ szintû molekuláris mozgások felderítése fontos szerepet játszhat a molekuláris felismerésért felelõs folyamatok megértésében. Ilyen mozgások például a proteinek gerinckonformációjának vagy oldalláncok konformációjának dinamikája. Ligandumok esetében többszörös kötôdési módok meghatározása, annak dinamikája válik vizsgálhatóvá. Ezeknek a molekuláris mozgásoknak a megváltozása a kötôdés hatására fontos szerkezet-hatás információval bír. Ugyancsak vizsgálható a fehérjék hidratálódása, a fehérje harmadlagos szerkezetét stabilizáló ún. szerkezeti víz dinamikai sajátságai.¹²
 

SAR by NMR módszer

Végezetül külön említését érdemel egy rendkívül ígéretes gyógyszertervezési stratégia, amelyet az Abbott cég fejlesztett ki és szabadalmaztatott.¹³ ...

A szerkezet-hatás összefüggés NMR-re alapozott vizsgálata elegáns módon ötvözi a racionális tervezés és a kombinatorikus kémia elemeit. A már említett ¹H-¹⁵N HSQC-kísérlet segítségével, az amid jelek kötôdés hatására történô megváltozását figyelve vizsgálnak egyszerre 10-20 kis molekulából álló keveréket. Ezzel a módszerrel, mérésidõt tekintve, egy nap kb. 1000 molekula tesztelhetõ. Miután azonosították, hogy a keverék melyik komponense kötõdik a fehérjéhez, meghatározzák K_d értékét. Majd, hogy affinitásnövekedést érjenek el, a vezérmolekulához hasonló szerkezetû analógokat vizsgálnak. Ezután az optimalizált elsõ ligandum jelenlétében további ligandumokat keresnek NMR-rel, amelyek az elsõ ligandum kötôdési helye közelében kötôdnek. A második ligandumot is optimalizálják, majd a két ún. vezérfragmens kiválasztása után, röntgenkrisztallográfia vagy NMR-spektroszkópia segítségével meghatározzák a vezérfragmensek helyét és orientációját a fehérje-ligandum harmadlagos komplexben. A két vezérfragmens egymáshoz és a fehérjéhez viszonyított orientációjának ismeretében olyan molekulát terveznek, amelyben a két vezérfragmenst megfelelõ kémiai lánc köti össze. Az így kapott molekula kötõdést tekintve bifunkcióssá válik, ami jelentõs affinitásnövekedést eredményez. Például a szervtranszplantációk során az immunválasz elnyomásában fontos szerepet játszó FKBP (FK506 kötõ protein) protein esetében egy K_d = 2 mM és egy K_d = 0,1 mM affinitású fragmens összekötésével K_d = 19 nM affinitást tudtak elérni.¹⁴ Hasonlóképpen, Stromelysin esetében egy K_d = 17 mM és egy K_d = 0,02 mM affmitású fragmensbõl egy K_d = 15 nM affinitású vegyületet terveztek kevesebb, mint hat hónap alatt.¹⁵
 

In vivo NMR

Az in vivo NMR-nek két fõ irányvonala rajzolódik ki. Az egyik irányvonal rövidítése MRI (Magnetic Resonance Imaging). Az MRI olyan noninvazív képalkotó eljárás, ami forradalmasította a klinikai diagnosztikát és a patológiát. Az MRI alkalmas élô szervezetek tetszôleges irányú metszetérõl rétegfelvételt készíteni, mely a legkülönbözõbb morfológiai jellegû elváltozások (infarktus, daganat, fejlôdési rendellenesség stb.) kimutatására használható. Gyógyszerkutatási szempontból az MRI különféle betegségek vizsgálatában, diagnosztikájában alkalmazható állatmodelleken vagy emberen, elõsegítve új gyógyszervegyületek hatékonyságának klinikai jellemzését.

A másik irányvonal neve MRS (Magnetic Resonance Spectroscopy), ami egy adott szövet vagy szerv lokalizált térfogatelemében képes molekuláris információt, vagyis spektrumot nyújtani (természetesen kisebb felbontással, mint a folyadékfázisú, nagyfelbontású NMR-készülékek). Az MRS gyógyszerkutatási alkalmazása leginkább a metabolitkutatásban (metabolitok alatt tágabb értelemben a szervezet endogén anyagait értve, pl. ATP, ADP, kreatin-foszfát, N-acetil-szpartát stb.), azon keresztül a betegségek patomechanizmusának molekuláris szintû felderítésében nyilvánul meg.
 

Összefoglalás

A szakirodalomban fellelhetõ adatok tanúbizonysága szerint az NMR-spektsoszkópia folyamatosan bôvülõ eszköztárával a modern gyógyszerkutatási stratégiák egyik fontos pillérét képezi. Az NMR alkalmazási köre kiterjed a gyógyszerfejlesztés korai (vezérmolekulák azonosítása és optimalizálása) és késõi (metabolizmus, klinikai jellemzés) szakaszára is. A molekuláris felismerésért felelõs receptor-ligandum kölcsönhatások atomi szintû vizsgálatán keresztül kiemelkedôen fontos információkat nyújt a szerkezet-hatás összefüggés felderítéséhez és az új terápiás készítmények kifiejlesztésében egyre sikeresebben alkalmazott szerkezet-, vagy receptoralapú gyógyszertervezéshez. A hazai gyógyszerkutatás tekintetében a makromolekuláris NMR-spektroszkópia meghonosítása és integrálása a kombinatorikus kémia, a HTS és a racionális gyógyszertervezés eszközeivel, a külföldi példák szerint, célszerûnek látszik. A rendelkezésre álló hazai erõforrások alapján a makromolekuláris NMR meghonosítása leginkább (legkisebb költséggel, leggyorsabban) kötôdésvizsgálatokban (pl. vezérmolekulák azonosítása) kezdôdhet eI.
 
 

HIVATKOZÁSOK
1. E. M. Purcell, H. G. Torrey, R. V. Pound, Phys. Rev., 69, 37 ( 1946).
2. a) F. Bloch, W. Hansen, M. E. Packard, Phys. Rev., 69, 127 (1946); b) F. Bloch, Phys. Rev., 70, 460 (1946).
3. I. I.. Rabi (1944, fizika); E. M. Purcell (1952, fizika), F. Bloch (1952, fizika), A. Kastler (1966, fizika), J. H. Van Vleck (1977, fizika), N. Bloembergen (1981, fizika), K. A. Müller (1987, fizika), N. R Ramsey (1989, fizika), H. G. Dehmelt (1989, fizikaj, R. R. Ernst (1991, kémia), J. Pople ( 1998, kémia).
4. a) NMR in drug design, Ed. D. J. Craik, CRC Press, New York (1996); b) NMR methods for elucidating macromolecule-ligand interactions: an approach to drug design, Eds. R. E. Handschumacher, I. M. Armitage, Proceedings of the fourth biochemical pharmacology symposium, New Haven, CT, July (1989); c) B. J. Stockman: NMR spectroscopy as a tool for structure-based drug design, Prog. NMR Spectr., 33. 109-151 (1998); d) M. Billeter, NMR for structural studies in drug discovery, 3. 151-167 (1995); e) S. W. Fesik, NMR structure-based drug design, J. Biomol. NMR, 3. 261-269 (1993); f) S. W. Fesik, NMR studies of molecular complexes as a tool in drug design, J. Med. Chem., 34. 2937-2945 (1991).
5. Hermecz István, Kánai Károly, Arányi Péter, Gyógyszerkutatás a Chinoinban, Magyar Tudomány, 1998. 9. sz.
6. a) K. Pervushin, R. Ruek, G. Wider, K. Wütrich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12366-12371 (1997); b) K. Pervushin, R. Ruek, G. Wider, K Wütrich, J. Am. Chem. Soc., 120, 6394-6400 (1998).
7. NMR of Macromolecules, Chapter 6, The Practical Approach Series, ed. G. C. K. . Roberts, Oxford University Press (1993).
8. a) H. Ponstingl, G. Otting, J. Biomol. NMR, 9, 441-444 (1997); b) P. J. Hajduk, E. T. Olejniczak, S. W. Fesik, J. Am. Chem. Soc., 119, 12257-12261 (1997); c) M. Lin, J. Shapiro, J. R. Wareing, J. Am. Chem. Soc., 119, 5249-5250 (1997); d) B. Meyer, T. Weimar, T. Peters, Eur. J. Biochem, 246, 705-709 (1997); e) N. Gonnella, M. Lin, M. J. Shapiro, J. R. Wareing, X. Zhang, J. Magn. Reson., 131, 336-338 (1998).
9. S. W. Fesik, P. J. Hajduk, E. Olejniczak WO 98/48264.
10. a) G. M. Clore, A. M. Gronenborn, J. Magn. Reson., 48, 402-417 (1982); b) A. M. Gronenborn, G. M. Clore, Biochem. Pharmacol., 40(1), 115-119, (1990).
11. a) G. Ottireg, H. Senn, G. Wagner, K. Wüthrich, J. Magn. Reson., 70, 500-515 ( 1986); b) S. W. Fesik E. R. P. Zuiderweg E. T. Olejniczak R. T. Gampe, Biochem. Pharmacol. 40(1) 161-168, (1990).
12. G. Wider, Progress in NMR Spectroscopy, 32, 193-275 ( 1998).
13. a) S. W. Fesik, P. J. Hajduk, E. Olejniczak WO 97/18469; b) P. J. Hajduk, R. P. Meadows, S. W. Fesik, Science, 278, 497-499 (1997 October); c) S. B. Shuker, P. J. Hajduk, R. P. Meadows, S. W. FesiK, Science, 274, 1531-1534 (1996 November)
14. S. B. Shuker P. J. Hajduk, R. P. Meadows, S. W. Fesik, Science, 274, 1531-1534 (1996 November).
15. a) P. J. Hajduk et. al, J. Am. Chem. Soc., 119, 5818-5827 (1997); b) E. T. Olejniczak et. al., J. Am. Chem. Soc., 119, 5828-5832 (1997).