Az utóbbi évtizedekben egyre növekvõ érdeklõdés kíséri a lipidek enzimatikus átalakítására irányuló kísérleteket, mely átalakításokban a fõ szerepet a lipázok játszák. A lipáz enzimmel (E.C.3.1.1.3.) katalizált triglicerid hidrolízis elõnye a kémiai zsírbontással szemben, hogy a termékek hõkárosodása kiküszöbölhetõ és a reakciókörülmények megfelelõ megválasztásával a trigliceridek hidrolízise irányíthatóvá válik, s így részlegesen hidrolizált származékok illetve azok keverékei is elõállíthatók. A reakciókörnyezet amelyben a lipolízis játszódik, minimum kettõ, de általában több, jól elkülöníthetõ fázisból áll. Fizikai tulajdonságaiknak megfelelõen, a szubsztrátok, a reakció közbensõ és végtermékei valamint az enzim ezen fázisok illetve határfelületi rétegek között oszlanak meg, amely a lipolízis elõrehaladtával folyamatosan változik.

Kutatómunkám célja egy állati (Pankreász)- és egy mikrobiális eredetû (Rhizopus sp.) lipáz enzim hidrolitikus aktivitásának növelése volt a fázishatárfelület, mint reakcióközeg különbözõ módszerekkel történõ módosításával. A fázishatárfelület nagyságát, valamint fiziko-kémiai tulajdonságait olyan adalékokkal módosítottam, amelyek vagy felületaktív tulajdonságaik révén képesek a határfelület módosítására, vagy a szubsztrát-enzim összekapcsolódását illetve a termék fázishatárfelületrõl történõ eltávolítását segítik elõ. Az elsõ meggondolás alapján a lipáz enzim fázishatárfelületi mûködéséhez nélkülözhetetlen emulgeáló (nátrium-taurokolát) és emulzióstabilizáló (gumiarábikum) anyagok koncentrációit valamint a hidrolízishez szükséges optimális reakcióparamétereket (hõmérséklet, pH), határoztam meg módosított szimplex módszerrel. A második meggondolás alapján a ciklodextrinek, mint hidrofób molekulákkal zárványkomplex-képzésre hajlamos anyagoknak a lipolízisre gyakorolt hatását tanulmányoztam.

A ciklodextrinek, mint zárványkomplexképzõ anyagok jelenlétében végzett enzimes triglicerid hasítási kísérletek eredményei alapján megállapítottam, hogy valamennyi vizsgált ciklodextrin kedvezõen befolyásolta a triolein pankreász lipázzal katalizált enzimes hidrolízisét. A b -ciklodextrin, a dimetil-b -ciklodextrin valamint a trimetil-b -ciklodextrin a metilezettségi fok növekedésével egyre fokozódó mértékben fejtették ki kedvezõ hatásukat.

A b -ciklodextrin lipolízisben betöltött kedvezõ hatásának vizsgálatára molekuladinamika számításokat végeztem. A lehetséges zárványkomplexek háromdimenziós szerkezetének szimulációs eredményei alapján a kísérletek során tapasztalt hidrolízis növekedést a stabil b -ciklodextrin - olajsav zárványkomplex létrejöttének tulajdonítottam, amely a reakció során képzõdõ olajsavakat a reakciófelületrõl eltávolítva csökkentette a termékgátlás következtében fellépõ inhibíciót.

 Az értekezés új tudományos eredményei:

A lipáz enzim reakciójának optimalizálására eddig még nem alkalmazott módosított szimplex módszert eredményesen használtam föl az enzim optimális mûködéséhez szükséges reakcióparaméterek meghatározásához.

A módosított szimplex módszer segítségével a mikrobiális eredetû lipáz enzim (Rhizopus sp.) aktivitását, csupán a reakció-paraméterek, valamint emulgeáló- és emulzió-stabilizáló anyagok megfelelõ megválasztásával, sikerült kétszeresére növelnem a faktoronkénti optimalizálás eredményeihez képest.

Elsõként vizsgáltam a b -ciklodextrin, a dimetil-b -ciklodextrin, a trimetil-b -ciklodextrin és két ciklodextrin polimer, mint zárványkomplex képzésére alkalmas anyagok lipolízisre gyakorolt hatását.

A kísérletek eredményeire alapozva molokuladinamikai számításokat végeztem, magyarázatot keresve a b-ciklodextrin lipolízisben betöltött kedvezõ hatására.

A molekuladinamikai számítások eredményei alapján megállapítottam, hogy a ciklodextrinek a triglicerid molekulákkal nem képeznek zárványkomplexet, kedvezõ hatásukat azáltal fejtik ki, hogy a lipolízisben felszabaduló zsírsavmolekulákkal alkotnak stabil zárványkomplexet, ezáltal csökkentve a reakció folyamán fellépõ termékgátlást.

Triglyceride hydrolysis as catalysed by lipases (EC 3.1.1.3) in aqueous environment is a slow process. The hydrolysis of these apolar substrates is a classic example of heterogeneous biocatalysis. The reaction rate of the hydrolysis depends directly on the concentration of the reactant within the surface phase and the partition of substrate, products and enzyme between the phases varies with the proceeding of lipolysis. Additives which either affect the size of the surface area or have an influence on the product inhibition might have a marked effect on the lipolysis.

The simultaneous effect of temperature, pH, gum arabic and sodium taurocholate concentrations on lipase enzyme activity from Rhyzopus sp. has been investigated. The sodium taurocholate as emulsifier (enlarging the surface area), the gum arabic as protective colloid for the emulsion play significant roles in lipolysis. The modified simplex method has been used to optimise the enzyme activity with respect to these parameters. The lipase enzyme activity was determined on olive oil substrate by pH-stat method measuring the fatty acids liberated during the enzymatic hydrolysis in an automatic titrimeter. The enzyme activity was by more than a hundred percent better than a previous result obtained by the "one-factor-at-a-time" method.

Based on the ability of b -cyclodextrin (bCD) and its partially methylated derivatives to form inclusion complexes, the hydrolysis of triolein by pancreatic lipase in aqueous solution in the presence of bCD, dimethyl-bCD and trimethyl-bCD has been studied. The liberated fatty acids were titrated with NaOH and the corresponding alkali consumption was monitored by pH-stat titration for two hours. The results showed that the hydrolysis of triolein by pancrease lipase in aqueous solution can be increased up to 2-3-fold by the addition of different types of CDs.

In the computational study extensive molecular dynamics simulations have been carried out in order to shed light on my previous hypotheses, based on the aformentioned experimental results, as to how cyclodextrin catalyzes lipolysis in aqueous solution. Two different mechanisms has been suggested based on two different cyclodextrin inclusion complexes; the bCD-triolein complex making the substrate more easily accessible for the enzyme in the aqueous phase, or the bCD-oleic acid complex removing the liberated fatty acids from the reaction zone, thus preventing product inhibition. The computer simulations clearly suggest that bCD cannot form a stable complex with triolein, but indeed, it can host the liberated oleic acid, forming a stable inclusion complex in aqueous solution. From the results I concluded that the up to 2-3-fold increase of lipolysis found experimentally in the presence of bCD derivatives can be attributed to the removal of the liberated fatty acids from the reaction zone at the final stage of the enzymatic hydrolysis by the formation of a stable bCD-oleic acid inclusion complex.

Publications

1. Györgyi J. Kolossváry and E. Bánky-Elõd Enhancement of Ensymatic Hydrolysis of Triolein in Aqueous Solution by Cylodextrin Derivatives. Biotechnol. Techn. 10(2), 115-120. (1996)

2. Györgyi J. Kolossváry and I. Kolossváry Molecular Dynamics Simulation of Cyclodextrin Inclusion Complexes in Enzymatic Lipid Hydrolysis. Biotechnol. Lett. 18(4), 440-444.(1996)

3. Györgyi J. Kolossváry Optimization of Lipase Activity from Rhizopus sp. in Triglyceride hydrolysis Using a Modified Simplex Method. Process Biochem. 31(6), 595-600. (1996)

4. Kolossváry J. Györgyi Enzimmûködést befolyásoló paraméterek optimálása módosított implex módszerrel. Magy. Kém. Foly., 102 (4), 197-202. (1996)

5. Györgyi J. Kolossváry, I. Kolossváry and E. Bánky-Elõd In Vitro and Computational Simulation of Cyclodextrin Inclusion Complexes in Enzymatic Lipid Hydrolysis. In: Minutes of the 8th. Int. Symp. on Cyclodextrins, Szejtli, J. and Szente, L. (Eds.) Kluwer Acad. Publ. /In press/