A korszerû analitikai méréseknek köszönhetõen ma már tudjuk, hogy az élõ szervezetet nemcsak az úgynevezett organogén elemek és a makroelemek építik fel. Ezek mellett – természetesen sokkal kisebb mennyiségben – a Földön permanensen jelenlévõ összes többi elem is megtalálható (a nemesgázok kivételével), melyeket gyûjtõnéven mikroelemeknek hívunk. A mikroelemek csoportjába összesen 65 elem tartozik. Egy részük bizonyítottan létfontosságúak az élõlények, illetve élõlénycsoportok számára (esszenciális vagy részlegesen esszenciális mikroelemek; pl. Fe, Zn, Cr, Se), más részüknek élettanilag kedvezõ hatásuk van (pl. Ti, Si, Li). A mikroelemekkel kapcsolatos ismereteink napról napra bõvülnek, így egyre több, ma még ismeretlen biológiai funkciójú elem kedvezõ élettani hatására derülhet fény.

Az anyagcsere folyamán fellépõ veszteségeket pótolni kell. Az emberi és állati szervezet normál körülmények között a szükséges mikroelemeket az élelembõl és az ivóvízbõl fedezi. Azonban az iparosodás, nagy mértékû kemizálás, környezetszennyezés következtében a Földön levõ mikroelemegyensúly drasztikusan megváltozott: míg egyes területek létfontosságú mikroelemekben elszegényedtek, addig, ezzel párhuzamosan, káros nehézfémek (Cd, Hg, Pb) dúsulása tapasztalható környezetünkben. A kedvezõtlen hatásokhoz járul hozzá napjaink tömegtermelése is. Így az élelmiszeriparban alkalmazott feldolgozási, finomítási technológiák eredményeként táplálékaink mikroelem tartalma tovább csökken.

A szervezet szükséges mikroelem-ellátása érdekében az élelmiszerek, takarmányok kiegészítésére számos próbálkozás történik. A nagyszámú külföldi és hazai kiegészítõ mikroelem forrásról elmondható, hogy – néhány kivételtõl eltekintve – általában szervetlen sókat tartalmaznak. A szakemberek számára közismert azonban, hogy a mikroelemek ilyen formában kevésbé hasznosulnak. (Fel kell hívni a figyelmet a ma megjelenõ újabb és újabb mikroelemes készítmények használatának lehetséges veszélyeire is, így például a túladagolás és a mikroelemek interakcióinak következményeire, ami multikészítményeknél még fokozottabb lehet, ezért csak megfelelõ körültekintéssel történhet a kiegészítések alkalmazása.)

Az élesztõk közismert akkumuláló képessége adta az ötletet újfajta, a szükséges mikroelemek pótlására szolgáló termékek kifejlesztésére. Ezekben azt a jelenséget használjuk ki, hogy a fermentáció során az élesztõhöz adott mikroelem a sejtekben feldúsul, és szerves (komplex) kötésben jelenik meg. Így a gyógyászatban, élelmiszeriparban és a takarmányozásban egyaránt felhasználható természetes alapú és könnyen emészthetõ mikroelem-forrásokhoz jutunk. A mikroelemek ilyen formájukban jobb abszorpciós hányadossal rendelkeznek, kevésbé toxikusak, kellemes ízûek, csökken a mikroelemek antagonista hatása. Ez lényegesen olcsóbb eljárás, mint mikroelemes szerves vegyületek, például aminosavak kémiai szintézise, és külön elõnyt jelent az élesztõk biológiailag értékes egyéb ásványanyag-, vitamin- és fehérjetartalma.

Az értekezésben három mikroelem – a részlegesen esszenciális króm, illetve az élettanilag kedvezõ szilícium és titán – dúsításával foglalkoztam. A dúsítások ezen elemek vízoldható vegyületeivel (Cr(III)-klorid, Na-szilikát és Ti-aszkorbát) történtek.

Kísérleteimben elsõsorban Saccharomyces cerevisiae pékélesztõt használtam, mivel ez a legismertebb, a legnagyobb mennyiségben alkalmazott, hozzáférhetõ engedélyezett élesztõ humán vonatkozásban. Ugyanakkor az akkumuláció véghez vihetõ egyéb perfekt és imperfekt élesztõnél is. Ennek igazolására dúsítási kísérleteket folytattam Candida utilis és Schizosaccharomyces pombe élesztõkkel is. A Candida utilis takarmányélesztõ alkalmazása elõtérbe kerülhet, amennyiben takarmányok komplettálása a cél.

Munkám során rázott lombikos növekedési ill. gátlási kísérletek, laboratóriumi fermentoros optimálás és a laboratóriumi eredmények félüzemi léptékre történõ adaptálása történt. A laboratóriumi fermentoros kísérleteket 10 dm³-es KUTESZ fermentorokban és egy BIOFLO III automatizált, számítógép-vezérelt bioreaktorban végeztem. A félüzemi léptéknöveléshez egy 150 dm³ hasznos térfogatú BIOSTAT fermentor állt rendelkezésre. Ezekkel a berendezésekkel meghatároztam a fermentáció optimális feltételeit (mikroelem-koncentráció, pH, tápanyag-összetétel, levegõztetés, adagolás, stb.), hogy a megfelelõ nagyságú mikroelem-beépülés megvalósuljon.

A biomassza elõállításával egyidejûleg, illetve azt követõen elemanalízisre került sor. A mikroelemek koncentrációjának meghatározása a fermentlében és az élesztôben induktívcsatolású plazma-atomemissziós (ICP-AES) módszerrel történt. Az élesztõbe ténylegesen szerves formában beépült mikroelem hányad meghatározása ultrahangos feltárást követõ elválasztás (vízoldható fehérjék kicsapásával együtt) után szintén ICP-AES módszerrel történt. A fermentációk végtermékébõl aminosav analíziseket is végeztem.

A mikroelem dúsításokat kétféle fermentációs eljárással valósítottam meg. Az úgynevezett szaporodósejtes eljárás során az élesztõt ismert módon és ismert táptalajon szaporítottam. A mikroelemek vízoldható sóit bemértem a tápoldatba, vagy a szaporítás közben adagoltam. A fermentáció végén a keletkezett biomasszát elválasztottam, mostam, majd szárítottam. Króm és titán esetében néhány ezer µg/g (~1500-5000) dúsulásokat értem el a körülményektõl függõen, míg szilícium esetében az akkumuláció egy nagyságrenddel kisebb volt (~ 200-700 µg/g).

A szaporodó élesztõkben történõ mikroelem-dúsításnak azonban van egy nagy hátránya: a tápoldathoz adagolt mikroelem sói legtöbbször kisebb vagy nagyobb mértékben gátolják az élesztõk szaporodását. Ezáltal csökken az egységnyi fermentor térfogatból kinyerhetõ élesztõ sejttömeg (biomassza) mennyisége, tehát csökken a szaporítás produktivitása.

Ez vezetett ahhoz a felismeréshez, hogy az elõbbi hátrány teljes mértékben megszüntethetõ, ha a mikroelem dúsítását nem-szaporodó, úgynevezett pihenõ sejtekben végezzük. Ebben az esetben a sejttömeg a szakaszos növekedési görbe vízszintes, stacioner szakaszával jellemezhetõ állapotban van. A sejtpusztulás még minimális, másképpen fogalmazva a sejtek túlnyomó része él, ezáltal képesek a mikroelemek akkumulációjára, mely metabolizmushoz kötött folyamat. Az elvégzett kísérletek alapján a pihenõsejtes akkumuláció elõnyei az alábbiakban foglalhatók össze:

• Mivel pihenõ sejtekkel dolgozunk, a mikroelemeknek a szaporodásra gyakorolt gátló hatása teljesen kiküszöbölhetõ.
• Mivel ismerjük az akkumulációhoz használt biomassza tömegét – és ez az akkumuláció alatt gyakorlatilag nem változik – pontosan tervezhetõ az akkumuláció mértéke és a felhasznált mikroelem mennyisége. Környezetvédelmi szempontból is fontos a felhasználandó mikroelem sójának minimalizálása.
• Jelentõs mértékben leegyszerûsödik az akkumulációs technika: néhány órára (3-24 óra) rövidül az akkumuláció optimális ideje; az akkumuláció félig sterilen is vezethetõ.
• A mikroelemekkel dúsított élesztõk elõállításának gazdaságossága nõ.
• Az akkumuláció megbízhatóan és pontosan reprodukálható.
• Az eljárás egyidejûleg egynél több mikroelem akkumulációjára is alkalmas.
• A biomassza elõállítása és a mikroelem akkumulációja idõben és térben szétválik, ezért az akkumuláció optimális körülményei pontosabban állapíthatók meg.

A pihenõsejtes eljárásnak megfelelõen az alkalmazott élesztõt kevés C- és N-forrást tartalmazó tápoldatban szuszpendáltam, temperáltam, kevertem és levegõztettem. Hozzáadtam az akkumulálandó mikroelem sóját, meghatározott idõ letelte után az élesztõsejteket elválasztottam, mostam és szárítottam. A tervezett dúsulás általában 500, illetve 1000 µg/g volt melyet sikerült elérni a kísérleti körülmények optimálása során. Az akkumulációhoz szeparált pékélesztõtejet, illetve préselt pékélesztõt használtam, azonban a dúsítás megvalósítható a melléktermékként keletkezõ szeszgyári és sörgyári fenékélesztõvel is, amennyiben a sejtek nem autolizáltak.

A krómos és titános pékélesztõ kémiai analízise további érdekes felismeréshez vezetett. Megfigyeltem, hogy króm és titán akkumulációja a szaporodó fázisban az élesztõ fehérjetartalmának 10-20%-os növekedését eredményezi. Különösen takarmányozási feladatoknál lehet e jelenségnek jelentõsége, mivel az értékes fehérjetartalom az élesztõ elõállításakor igen kis mennyiségû króm, illetve titán hozzáadásával megemelhetõ.

A mikroelemek beépülését meghatározó ultrahangos feltárás mellett a félüzemi körülmények között, pihenõsejtes eljárással elõállított Cr-élesztõben az akkumulált króm sejtbéli eloszlásának meghatározása is megtörtént úgynevezett differenciális extrakcióval, melynek lényege, hogy a sejtmembránt és a sejtalkotó membránt fokozatosan tesszük átjárhatóvá a mikroelemek számára. Az így megállapított szerves hányad (kötött frakció: 59%) alig tért el a korábbi ultrahangos feltárás eredményétõl (57%).

A mikroelemekkel dúsított élesztõk a jövõben a legkülönbözõbb élelmiszeripari termékekben (sütõipar, húsipar, édesipar), paramedicinális szerekben, kozmetikai készítményekben valamint a takarmányozásban találhatnak alkalmazásra. Ezt támasztják alá a többek között krómos élesztõvel végzett állatetetési kísérletek is.

It can be verified by current sensitive analytical methods that all 88 elements (except noble gases), as permanent constituents of our Earth may also be detected in living organisms. Eleven of these elements, named macro-elements, constitute near or more than 99 per cent of the living organisms, and carbon, oxygen, hydrogen and nitrogen are of primary importance as components of the vital macromolecules of the living organism (proteins, carbohydrates, fats, nucleic acids). The remaining 65 elements of the periodic system, that constitute the group of micro-elements, are present in the living organism, usually in mg/kg amounts, some of them only in trace amounts (µg/kg).

The necessary amount of micro-elements required for the living organism to function normally can be ensured by appropriate nutrition. In general, the consumption of drinking water, beverages and food supplies the organism with sufficient amount of micro-elements. The soil of some geographical areas, however, is deficient in certain elements required by plants. On the other hand mass-production led up to make our nutriments rather incomplete. Problem of vitamin and micro element deficiency in modern nutriments is well-known.

To improve the mineral substance content of food products there are different attempts. Foods and feeds are most commonly completed using the inorganic salts of the given macro- and micro-elements. Some elements may be required even in higher amounts than consumed in normal nutrition. In form of inorganic salts, micro elements are usually absorbed in living organism rather slightly. So scientists have been interested in organic micro element compounds.

Under certain conditions, yeasts are able to take up micro elements and form organic (complex) bonds at concentrations several times higher than the normal level. These novel micro-element resources are more suitable for, and favourable to, both human and animal organism. In this form the micro-elements show better absorption quotients, are less toxic, have a pleasant taste and are easier to portion in dosages and to package. Another benefit is the protein of full value and high vitamin content of the yeast. Thus, by microelement enrichment of yeast we may obtain a new natural source of microelements.

In the course of investigations I enriched three micro elements – chromium, silicon and titanium – in yeast cells. The strain we used for accumulation was first of all Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast). In addition there were experiments with Candida utilis (yeast for feedstuff) and Schizosaccharomyces pombe.

I used two accumulation methods: enrichment in growing cells and enrichment in non-growing cells.

In the course of growing cell method the yeast is grown in laboratory scale fermenter in the traditional nutrient medium using well-known methods. Water-soluble salts of the micro elements are either weighed and added to the nutrient medium, or supplied in the course of yeast cultivation. The amounts are added either periodically or continuously, depending on the inhibitory effect of salt of the desired micro element. The selection of proper water-soluble salt for each micro element was carried out by preliminary experiments in shaking flasks cultivation by measuring the growth and micro element accumulation. The selected compounds were chromium(III)-chloride, sodium-silicate and titanium-ascorbate.

After cultivation the biomass was separated, washed, filtered and dried. The concentration of micro elements both in the medium and the yeast were determined by Inductively Coupled Plasma Atomic Emission System (ICP-AES).

Depending on the strains and circumstances the chromium and titanium enrichment achieved about 1500-5000 µg/g, in case of silicon the accumulation was lower (~ 200-700 µg/g).

However, there is a big disadvantage of the micro-element accumulation in growing yeast cells: the micro-element salts added into the medium usually inhibit the yeast growth. For this reason the amount of the yeast biomass decreases, thus the productivity of cultivation reduces.

This disadvantage could be eliminated completely, if the micro-element accumulation occurs in non-growing, so-called „resting” yeast cells.

In this resting cell method the uptake period was an essentially non-growth period where the yeast cells in the fermenter were in an aqueous suspension in the presence of the dissolved micro-element salt. I calculated the micro-element addition basing the dry material content of the applied separated baker’s yeast milk or pressed baker’s yeast. This method has numerous advantages in comparison to growing cell accumulation:

• the required addition of trace element can be calculated more exactly;
• inhibitory effect of trace element can be eliminated almost completely;
• the fermentation technique becomes simple significantly:
  - reduced fermentation time (3-24 h); 
  - it can be carried out in semi-sterile;
  - the fermentation can be monitored by the measurement of solved oxygen level;
• the economy of production is improved;
• the accumulation can be reproduced correctly;
• the method is suitable to realise the simultaneously addition of more micro elements;
• the biomass production and the micro element accumulation are separated in time and space, therefore the optimisation of accumulation can be determined more accurately.

The planned 500 or 1000 µg/g uptake was managed with the resting cell method during the experiments.

Chemical analysis of enriched yeasts has revealed further interesting information. In growth phase accumulation Ti or Cr increased protein content of the yeast with 10-20 per cent. This increase can be of importance in industrial production of yeast for feedstuff.

An important feature of micro-element enriched yeast is that most of the micro-elements accumulated in the yeast are in organic (or complex) bonds. For approximate control of incorporation micro-element containing cells were disrupted in ultrasonic wave equipment. After separation of the solid moieties and the filtrate Ti, Si and Cr contents of the cell organelles and precipitated proteins were measured by ICP. These amounts differed only 10-40% from the total quantity uptaken.

To confirm this feature I used another method so-called differential extraction for approximate control of incorporation and cellular distribution of the chromium uptaken by yeast cells produced by resting cell method in pilot plant scale. In this method the membranes of cell and cell organelles became permeable against the ions gradually, then measurement the concentration of the ions occurred by ICP-AES in the obtained extracts. The incorporation results corresponded with results of the previous method.

The field of application of micro-element enriched yeasts is quite wide: i.e. supplement of food products; supplement of feed products and production of premixes; in paramedicinal products; in cosmetics.

Publications

 1. J. Hegóczki, B. Janzsó, Á. Suhajda: Preparation of titanium enriched yeasts. Acta Alimentaria, 24(2) (1995) 181-190.  

2. J. Hegóczki, B. Janzsó, Á. Suhajda, G. Vereczkey: Microelement enrichment in non-growing yeast cells. Acta Alimentaria, 26(1) (1997) 86-87. 

3. J. Hegóczki, Á. Suhajda, B. Janzsó, G. Vereczkey: Preparation of chromium enriched yeasts. Acta Alimentaria, 26(4) (1997) 345-358.