Értekezésemben szintetikus IL-6 peptidek segítségével azt vizsgáltam, hogy a fehérje N- és C terminális szakaszán mely régió(k) felelõsek az IL-6 által kiváltott biológiai hatásért, illetve az IL-6R kötõdésért. Az N- és C-terminális régió 17-46 és 168-185 szakaszát szintetikus peptidekkel modelleztem annak érdekében, hogy a régiók szerepét ilyen megközelítéssel vizsgáljam. Az IL-6R esetében tanulmányozni kívántam a WSXWS motívum szerepét. Ezért döntöttem az ezen szakaszokat reprezentáló peptidek szintézise, valamint peptidkonjugátumok felhasználásával a WSEWS-specifikus monoklonális ellenanyagok elõállítása és vizsgálata mellett. Az a-lánc esetében a WSEWS pentamer a 284-288 régióban van jelen, míg a b-lánc esetében a WSDWS részlet a 310-314 szakaszon található. Tekintettel arra, hogy az oldatbeli konformációnak fontos szerepe lehet a biológiai hatás kiváltásában az IL-6 és IL-6R peptidek oldatbeli térszerkezetét is tanulmányoztam.
 
 

A peptidek szintézise és jellemzése

Az N-terminális 17-46 szakaszt 8 átlapoló oktapeptiddel, illetve 3, a régiót részben vagy teljes egészében lefedõ peptiddel reprezentáltam. Mutáns fehérjékre vonatkozó irodalmi adatok alapján a ⁴⁵Cys aminosav szerinnel helyettesíthetõ, ennek megfelelõen a peptidekben Cys—>Ser cserét alkalmaztam. Szintetizáltam továbbá olyan peptideket is, amelyekbe (irodalmi adatok alapján meghatározott) kritikus pozíciókban aminosavcseréket hajtottam végre. Elkészítettem egy, a 168-185 C-terminális szakaszt magában foglaló peptidet, valamint hét, az N- és a C-terminális felõl szisztematikusan rövidített vegyületet.

A peptideket a szekvencia elemzése után, az aminosavak minõségétõl függõen Boc/Bzl, Fmoc/tBu, valamint ezek kombinációjával építettem. A választott stratégiától függõ hasítás után a nyers peptidek tisztasága 75-85 %-os volt, az RP-HPLC tisztítást követõen homogenitásuk pedig elérte a 95-99 %-ot. A C-terminálison metionint tartalmazó peptidamidok szintézisére az Fmoc/tBu módszerrel polisztirol alapú gyantán bizonyult hatékonynak.

Az IL-6Ra "WSEWS-peptideket", valamint a gp130 (IL-6Rb) WSDWS peptidet (triptofán tartalmukat figyelembe véve) Boc/Bzl stratégiával, N₂ atmoszférában vagy Fmoc/tBu módszerrel építettem fel. A hasításokat követõen a nyers peptidek tisztasága 80 % körüli volt, tisztításukat követõen pedig 95-99 %-nak adódott.
 
 

Fluoreszcens peptidszármazékok szintézise és jellemzése

A kötõdésvizsgálatokhoz naOx-OEt-nal jelzett peptideket állítottam elõ. A peptideket Boc/Bzl, Fmoc/tBu és Fmoc/tBu/MBHA stratégia szerint építettem fel. A fluorofor csoport bevitelét szilárd hordozón (az utolsó N^a-védõcsoport hasítását követõen), valamint N^a-naOx-aminosavszármazék beépítésével Boc/Bzl és Fmoc/tBu stratégia szerint is megvalósítottam. Peptideket néhány esetben oldatban is reagáltattam naOx-OEt-nal.

Megállapítottam, hogy a peptid és a naOx-csoport között létrejött kötés a szilárdfázisú peptidszintézis körülményei között stabil. Az általam választott peptidek esetében az oldatban való jelölési stratégia kevésbé bizonyult alkalmazhatónak, mert a nyerstermék tisztítása nagy veszteségekkel volt megvalósítható. A peptidek spektroszkópiai jellemzése azt bizonyította, hogy a jelölt peptidek elõnyös fluoreszcencia paramétereket (kvantumhatásfok, emissziós és gerjesztési maximumok helye és távolsága) mutatnak, a peptidlánc összetétele jelentõs mértékben nem befolyásolja ezeket a sajátságokat. Megállapítottam, hogy a naOx-peptidek fluoreszcencia intenzitása változik abban az esetben, ha a jelölt peptid kötõdik a sIL-6R^a-hoz.
 
 

Az IL-6 peptidek oldatbeli konformációja

Predikciós számítások és CD mérések segítségével megállapítottam, hogy az IL-6 fehérje A-hélix (20-48) valamint a D-hélix (154-185) régióját részben modellezõ peptidszakaszok kifejezetten alkalmasak és képesek rendezett szerkezet oldatbeli felvételére.

A 17-46 szakaszt reprezentáló oktapeptidek között néhány peptid esetében a rendezett térszerkezet felvételére való hajlam erõs. A peptidek közül rendezettségét tekintve kiemelkedik a H-¹⁸QPLTSSER²⁵-NH₂ és a H-²⁷DKQIRYIL³⁴-NH₂. Érdemes megjegyezni, hogy a H-²⁷DKQIRYIL³⁴-NH₂ peptid nagyfokú rendezettségét TFE/víz 1:1 (V/V)
elegyben is megtartja. A 17-46 régiót lefedõ H-¹⁷RQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETSN²⁵-NH₂ peptid, valamint az N-terminálison 9 aminosavval rövidített változat és a H-³⁶GISALRKETSN⁴⁶-NH₂ peptidek spektruma TFE-ben szintén rendezett szerkezeti elemek jelenlétét mutatta. A TFE/víz 1:1 (V/V) oldószerkeverékben a 21 és 30 aminosavtagszámú peptidek megõrzik a rendezett (feltételezhetõen helikális) másodlagos szerkezetüket. Víz hozzáadása következtében a H-³⁶GISALRKETSN⁴⁶-NH₂ peptid spektrumában a helikális jelleg eltûnik, de valószínûsíthetõ a kanyar konformerek elõfordulása. Az aminosavcseréket tartalmazó peptidek esetében a natív szekvenciájú peptidekhez képest a H-²⁷DKQIR³²DIL³⁴-NH₂, H-³⁰IRYIL³⁵YGI³⁷-NH₂ peptideknél a rendezetlen másodlagos szerkezeti elemek jelenlétének növekedését tapasztaltam.

A C-terminális peptidek (168-185 szakasz) CD spektruma a rendezett (feltételezhetõen helikális) másodlagos szerkezeti elemek jelenlétét mutatta. Az N-terminális 3 aminosav hiánya még nem befolyásolja jelentõs mértékben a peptid hélix-képzési hajlamát (H-¹⁷¹FKEFLQSSLRALRQM¹⁸⁵-NH₂). Ugyanakkor 6 aminosavrész (H-¹⁷⁴FLQSSLRALRQM¹⁸⁵-NH₂) vagy a C-terminális 3 aminosav eltávolítása (H-¹⁶⁸LRSFKEFLQSSLRAL¹⁸²-NH₂) már nagymértékben rontotta a rendezett másodlagos szerkezet kialakulásának lehetõségét.
 
 

Az IL-6R peptidek konformációja

A két triptofánt tartalmazó peptidek esetében szinte azonos lefutású - bizonyos mértékû rendezettségre utaló - CD görbéket kaptam TFE-ben és TFE/víz 1:1 (V/V) elegyben. Ez valószínûleg a két indolgyûrû kölcsönhatása miatt jön létre, hiszen a peptidek mindössze 5-7 aminosavból állnak. A peptidek spektrumából látszik, hogy a konformerelegyben a rendezetlen (aperiodikus) elemek is jelen vannak. Érdekes megjegyezni azt, hogy a konformerelegyek öszetétele nem változott meg víz hozzáadása következtében sem.
 
 

A peptidek biológiai hatása

Az IL-6 peptidek hatása HepG2 sejtek fibrinogén termelésére

Az N-terminális és C-terminális peptideket a fibrinogén szintézisre gyakorolt hatás szempontjából a következõ csoportokra oszthatom: azok a peptidek, amelyek önmagukban csökkentették a fibrinogén szintjét a sejtek felülúszójában; amelyek növelték; valamint amelyek ebben a kísérletben hatástalannak bizonyultak. A H-²¹TSSERIDK²⁸-NH₂ és a H-²⁷DKQIRYIL³⁴-NH₂ peptid mind önmagában, mind rhIL-6 jelenlétében csökkentette a fibrinogén mennyiségét a sejtek felülúszójában. Mivel a peptidek nemcsak rhIL-6 jelenlétében, hanem önmagukban is csökkentették a fibrinogén mennyiségét, felmerülhet a gyanú, hogy ez a hatásuk nem az IL-6R komplexen keresztül érvényesül. Ennek tisztázása érdekében további vizsgálatok szükségesek. Az aminosavcseréket tartalmazó peptidek hatástalanok, ez azt mutatja, hogy a ³²Tyr aminosav jelenléte fontos. A 45. és 46. pozicióban lévõ aminosavak felcserélése szintén megszünteti a peptid hatását. A C-terminális peptidek esetében az adatok azt mutatják, hogy a 171-182 szakasz jelenléte lényeges a hatás szempontjából.

A mindkét típusú (peptid, peptid + IL-6) kezelés során serkentõ hatást mutató peptidek esetében elõfordulhat receptorkötõdés, hiszen hatásuk - bár kismértékben - "IL-6-szerû”. Az önmagukban hatástalan, kombinált kezelésekben gátló peptidek hatásának egy lehetséges magyarázata az lehet, hogy ezek a peptidek (konformációjuk, aminosavtagszámuk, aminosavsorrendjük miatt) nem alkalmasak hatás kiváltására. Ugyanakkor a kombinált kezelésben mutatott gátló hatás szerint - ha kötõdnek is a receptorhoz - nem indítják be a jelátviteli folyamatot. Az önmagukban és rhIL-6 jelenlétében gátló peptideknél valószínûsíthetõ, hogy a kötõhely blokkolása miatt nem érvényesülhet a rhIL-6 hatása a kombinált kezelések esetében.

Az IL-6 peptidek hatása HepG2 sejtek junB mRNS expressziójára

A hatást mutató peptidek szekvenciája a következõ:

N-terminális:

¹⁸QPLTSSER^{25
        27}DKQIRYIL^{34
        26}IDKQIRYILDGISALRKETSN^{46
                36}GISALRKETSN^{46
                36}GISALRKE⁴³

C-terminális:

¹⁶⁸LRSFKEFLQSSLRAL^{182
            171}FKEFLQSSLRALRQM^{185
                             174}FLQSSLRALRQM^{185
                                              179}LRALRQM^{185
                                                                179}LRALRQ¹⁸⁴

A peptidek önmagukban serkentették, rhIL-6 jelenlétében azonban gátolták, vagy nem befolyásolták a junB mRNS expresszióját. Ezek az adatok azt jelenthetik, hogy a peptidek képesek a receptorhoz, vagy annak egy részéhez kötõdni. Valamilyen mértékben kiváltják a jelátviteli folyamatot, viszont affinitásuk elég nagy ahhoz (lásd kombinált kezelések), hogy a rhIL-6 ne tudja a peptideket leszorítani a kötõhelyrõl. Az adatok alapján a H-¹⁷QPLTSSER²⁴-NH₂, H-²⁷DKQIRYIL³⁴-NH₂ és H-¹⁷⁹LRALRQ¹⁸⁴-NH₂ peptidek affinitása a legnagyobb, ezek önmagukban és a kombinált kezelésekben ugyanolyan mértékû hatást mutatnak.

Egyes peptideknél (H-²⁶IDKQIRYILDGISALRKETSN⁴⁶-NH₂, H-¹⁷⁹LRALRQM¹⁸⁵-NH₂ és H-¹⁶⁸LRSFKEFLQSSLRAL¹⁸²-NH₂) a kombinált kezelések során nagyobb génexpresszió értéket kaptam, mint amit a peptidek önmagukban képesek voltak indukálni. Ez azt jelezheti, hogy ezen peptidek affinitása a kötõhelyhez (vagy annak egy részéhez), kisebb, mint a rhIL-6 affinitása; a peptid a kötõhelyrõl részben leszorítható és a rhIL-6 hatása valamilyen mértékben érvényesül. Más peptidek (H-¹⁷¹FKEFLQSSLRALRQM¹⁸⁵-NH₂, H-³⁶GISALRKE⁴³-NH₂) – bár önmagukban serkentették a génexpresszió mértékét – a kombinált kezelésekben nem befolyásolták a rhIL-6 hatását.

Az aminosavcseréket tartalmazó peptidek nem befolyásolták sem önmagukban, sem a kombinált kezelések esetében a génexpressziót. Ez ismét megerõsíti a ³²Tyr aminosav és a 45. és 46. pozicióban lévõ aminosavak relatív helyzetének fontosságát.

Az IL-6Ra peptidek és a WSEWS-specifikus monoklonális ellenanyagok hatása HepG2 sejtek fibrinogén termelésére és a junB mRNS expressziójára

A "WSEWS-családba" tartozó peptidek a H-²⁸⁴WSEWS²⁸⁸-NH₂ kivételével, nem befolyásolták a HepG2 sejtek fibrinogén szintézisét a vizsgált koncentráció tartományban rhIL-6 jelenlétében sem. Hasonló megfigyeléseket tettem a junB mRNS expressziójára vonatkozóan is.

A monoklonális ellenanyagok közül egy önmagában, és rhIL-6 jelenlétében is serkentette a fibrinogén szintézisét. Ez a megfigyelés azt jelzi, hogy a jelátvitel befolyásolható WSEWS-specifikus ellenanyaggal.

Kísérleteim bizonyították, hogy a szintetikus peptidek, fluoreszcens-peptidszármazékok és peptid-specifikus monoklonális ellenanyagok felhasználásával új információkat kaphatunk az IL-6 szerkezet-hatás összefüggések feltárásához.

Köszönöm Dr. Hudecz Ferenc tudományos tanácsadónak, munkám témavezetõjeként nyújtott értékes és útmutató tanácsait, türelmét, észrevételeit, amelyekkel segítségemre volt a téma kidolgozásában és a dolgozat elkészítésében. Köszönöm Dr. Falus András egyetemi tanárnak (SOTE Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet igazgatójának) és munkatársainak az együttmûködést. Köszönöm Dr. Szekerke Máriának, hogy figyelemmel kísérte és segítette munkámat. Köszönöm az ELTE II. Peregrinatio Alapítvány, a TEMPUS 21-13 Joint European Project, az OTKA (T 021120) támogatását. Köszönöm a Soros Alapítványnak, hogy értekezésem elkészítését támogatta.
 

Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine playing a pivotal role in immune and inflammatory responses. It exerts its activity through interaction with receptor complex, consisting of a ligand binding a- and a signal transducer b-chain. Based on experiments with point and deletion IL-6 mutants, the involvement of the N- and C-terminal parts of IL-6 in receptor binding were postulated. The aim of the present investigations was to study the role of these regions using the synthetic peptides approach. Three group of synthetic peptides corresponding to the 17-46 and 168-185 regions of the IL-6 and 282-288 part of the IL-6Ra were prepared by solid phase synthesis method. In addition, monoclonal antibodies specific for the IL-6Ra were developed. The solution conformation of these peptides was investigated, and studies were initiated to assess their IL-6 related biological properties.

Peptide synthesis The full length, the overlapping and truncated peptides corresponding to the 17-46 N-terminal region of the 185-residue isotype version of IL-6 were prepared by Fmoc or Boc strategy. Methionine-containing peptides derived from the 168-185 C-terminal region of IL-6 were synthesised either by Boc strategy applying N₂ atmosphere or by Fmoc/tBu side chain protection scheme on the MBHA resin. The tryptophan-containing 282-288 IL-6Ra peptides were produced using both Boc and Fmoc strategies. The homogeneity of the RP-HPLC purified new compounds was checked by analytical RP-HPLC and was found to be > 95-99%. The primary structure of peptides were verified by amino acid analysis, FAB-MS and/or PD-MS.

Solution conformation of peptides were studied by CD spectroscopy in solution. These results showed that both 17-46 and 168-185 peptides are able to adopt markedly ordered conformation under appropriate conditions. The CD curves demonstrated that even relatively small linear oligopeptides preserved some tendency to form periodic conformation in TFE, however, there are marked differences in the type of secondary structures formed.

Synthesis and application of fluorescent derivatives of IL-6 peptides: 4-ethoxymethylene-2-[1]-naphtyl-5(4H)-oxazolone (naOx-OEt) labelled peptides were prepared by coupling naOx-OEt with semiprotected peptides attached to solid support or with unprotected peptides in solution. The naOx-peptides were used for binding studies. The interaction between soluble IL-6Ra and labelled peptides were monitored by fluorescence spectroscopy. Data showed that the fluorescence properties of the naOx-peptides can be efficiently used for detection of receptor binding.

Anti-WSEWS monoclonal antibodies: Using H-WSEWS-NH₂ peptide-AK and -BSA conjugates, IgG type WSEWS-specific antibodies were developed and one of them was capable to modulate junB gene expression and fibrinogen synthesis on HepG2 cells.

The biological effect of synthetic peptides on HepG2 cells N- and C-terminal peptides induced changes in fibrinogen production and junB gene expression of human hepatoma cells in the absence or in the presence of recombinant human IL-6 (rhIL-6). Production of the fibrinogen was monitored by ELISA, while mRNA expression of junB was detected by competitive RT-PCR.

The effect of peptides and rhIL-6 on MDA MB 435 cells: Treatment was develop to investigate the effect of rhIL-6 and synthetic peptides on MDA MB 435 human breast cancer cells. Two N-terminal peptides have cytostatic effect on these cells.
 
 

Publications
1. Bõsze Sz., Mák M., Medzihradszky-Schweiger H., Hudecz F.: Chromatographic characterization of HSV1-gD 268-284 and IL-6 179-185 synthetic oligopeptides by reversed-phase high performance liquid chromatography, automated Edman degradation and mass-spectrometric analysis. J.Chromatog. A 668 (1994) 345-351.
2. Hudecz, F., Hilbert, ç., Mezõ, G., Mucsi, I., Kajtár, J. Bõsze, Sz., Kurucz, I. Rajnavölgyi, É.: The use of branched polypeptide carrier based conjugates for the design of synthetic vaccine against HSV infection. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis - Peptides, Polypeptides and Oligonucleotides - 1994 (Ed. Epton, R.) 1994, Intercept, Andover pp.315-320.
3. Bíró J., Bõsze Sz., Hudecz F., Nagy Z., Rajnavölgyi É., Schmidt B., Rákász É., Falus A.: The effect of WSEWS pentapeptide and WSEWS-specific monoclonal antibodies on constitutive and IL-6 induced acute phase protein production by human hepatoma cell line, HepG2. Immunology Letters46 (1995) 183-187.
4. Mezõ, G., Mák, M., Bõsze, Sz., Hudecz, F.: Application of different protecting groups and cleavage methods in the synthesis of peptide epitopes of Herpes simplex virus (HSV) glycoprotein D. In: Peptides 1994 Proc. 23nd European Peptide Symposium, (Ed.: H.L.S. Maia) 1995, ESCOM, Leiden, pp. 299-300.
5. Bõsze Sz., Bíró J., Falus A., Hudecz F.: The effect of synthetic peptides corresponding to the WSEWS domain on production of the acute phase proteins. Perspectives on Protein Engineering & Complementary Technologies. (Geisow, M.J. and Epton, R., eds.) Mayflower Worldwide, Birmingham (1995) 239-242.
6. Kóczán Gy., Bõsze Sz., Hudecz F.: Synthesis and application of naphthyl-oxazolone derivatives of amino acids. Amino Acids 9 (1995) 70.
7. Tóth S., Bõsze Sz.: Different action of LIF and IL-6 on parental and metastatic breast cancer cells. Int. Medical J. Exp. Clin. Res. Medical Science Monitor 2 (1996) Suppl.3 19-20.
8. Bõsze Sz., Igaz P., Takács K, Szabó R., Tobisch Zs., Tóth S., Falus A., Hudecz, F.: Modulation of junB mRNA expression and of acute phase response of HepG2 cells by WSXWS motif related peptides and monoclonal antibodies. The Immunologist S1, 516, 1998.
9. Bõsze, Sz., Kajtár, J., Szabó, R., Falus, A., Hudecz, F. Synthesis, solution conformation and interleukin-6 activities of interleukin-6 peptides J. Pep. Res. 52 216-228. (1998)
10. Bõsze, Sz., Igaz, P., Szabó, R., Tobisch, Zs., Tóth, S., Falus, A., Hudecz, F.: Interleukin-6 peptides modulate the production of acute phase proteins and the expression of junb protooncogen on HepG2 cells. In: Peptides 1998. Proc. 25^th European Peptide Symposium, (Ed.: Bajusz, S., Hudecz, F.) 1999, Akadémiai Kiadó, pp. 568-569.
11. Bõsze, Sz., Kóczán, Gy., Csik, G., Falus, A., Hudecz, F.: A New Fluorophore for peptide labelling: synthesis and analysis of its interaction with Interleukin-6 receptor. In: Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis & Combinatorial Libraries, 1998 (Ed. Epton, R.) Mayflower Ltd, Birmingham, UK (1999), pp 189-192.