A PhD munkámban leírt technikák jól ismertek a hasonló témákban dolgozó kutatói közösségek számára, ám e módszereknél általában kevés figyelem fordítódik a lehetséges nagy mennyiségû vizsgálatok elvégzésére. Azon a tényen alapulva, hogy 1992-1993-ban alapított DNS laboratóriumunk elsõsorban a tenyésztõk mindennapi rutinjához és versenyképességük fenntartásához kapcsolódó feladatok ellátására lett létrehozva, fontosnak éreztem a meglévõ módszerek folyamatos fejlesztését a magas színvonalú tenyésztési munka biztosításához valamint olyan új DNS alapú tipizálási módszerek kidolgozását, melyekre kereslet mutatkozott.

A munkám célja volt: i.) megalapozni egy gyors és megbízható módszer kidolgozását, bármely állati eredetû termék komponenseinek meghatározására, ii.) felgyorsitani a BLAD és k-kazein tipizálását a vizsgálatra fordított munka idejének és költségének csökkentésével párhuzamosan, iii.) BLAD genotipizálást javítani az eredeti teszt nehézségei miatt, iv.) kifejleszteni egy DNS alapú eljárást a juh b-laktoglobulin C alléljának azonosítására, mely további kutatások alapjául szolgál.

A BSE (bovine spongiform encephalopathy) megjelenése erõfeszítéseimet abba az irányba terelte, hogy az állatok részére összeállított takarmánykeverékekben fehérje visszacirkuláltatás céljából használt, különféle szövetek hõkezelésével és homogenizálásával elõkészített tápanyagkiegészítõk, javítók (vérliszt, halliszt) eredetét meg tudjam határozni.

Erre a célra RAPD (randomly amplified polimorphic DNA) és PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) technikákat használtam.

RAPD által produkált komplex DNS fragmentek olyan megbízható, nagy elválasztási erõvel bíró elektroforetikus rendszer használatát követelte meg, amelyre a többfázisú puffer rendszer adta a megoldást. Bár a vérliszt azonosítás egyszerû feladatnak tûnik akár RAPD-dal vagy más típusú PCR alkalmazásokkal, de az eredmények megbízható detektálása és interpretációja óriási mértékben függ az elválasztás hatékonyságától. Az általában használt TBE (Tris-borát-EDTA) puffer rendszernek néhány hátránya van, ha azt komplex DNS mintázat elválasztására használják, ami indokolja a többfázisú puffer rendszerek alkalmazását speciális esetekben. A többbfázisú puffer rendszer kiválónak bizonyult komplex DNS fragmentek gyors, hatékony elválasztására a felbontás romlása nélkül.

A szarvasmarha k-kazein (a tej fontos fehérjéje, amely befolyásolja a tej beltartalmi értékét) és BLAD (egy örökölhetõ immunhiányos szindróma) egyidejû meghatározását (multiplexálás) kidolgoztam, alkalmazására tenyésztõi programokban került sor

Máshol leírt kutatásainkhoz szükség volt juhtej b-laktoglobulin C típusának DNS alapú detektálására is. Az adatbázisokban talált fehérje szekvencia „visszafordítása” és a b-laktoglobulin gén szekvencia összevetésével sikerült az egyetlen lehetséges mutációt azonosítanom, melynek eredményétt késõbb egy független laboratórium is igazolta.
 
 

Köszönetem fejezem ki Dr. Szalai Gábornak, Dr. Lásztity Radomirnak, és Dr. Salgó Andrásnak (BME, Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék), Dr. Fésüs Lászlónak (ÁTK, Genetikai osztály) akik támogatták e munka önálló doktori cselekmény keretében való elkészülését, valamint Dr. Orbán Lászlónak (Laboratory of Fish Biotechnology, Institute of Molecular Agrobiology, Singapure) aki számtalan esetben segítségemre volt hasznos tanácsaival.
 
 

* Kutatási hely: Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet, Genetikai osztály, Herceghalom

The reliable, robust techniques described in this study are well known for the research community. However they are designed for getting answers for a certain research problem usually no attention is paid for the possible mass applications.

In our laboratory, one part of our efforts is to find fast or user friendly, fast solutions for given demands.

So my aims were i.) to make a basement of a further investigation of a fast and reliable identification method of bloodmeal components, ii.) to improve BLAD genotyping, because of the difficulties of the original test, iii.) to speed up the genotyping of BLAD and k-casein by simultaneous analysis in order to reduce labour and cost, iv.) to develop a DNA based method in order to detect a milk protein genotype of sheep (b-lactoglobulin C), which detection method could serve further investigations.

Bloodmeal has been used for protein feed-back in animal feeding. The emergence of bovine spongiform encephalopathy drove my efforts to track down the origin of tissues used for mixtures offered as meal supplements for animals.

The use of multiphasic electrophoretic system is emerged from the need of reliable, highly resolved DNA fragments produced by RAPD. Although bloodmeal identification appears to be a rather simple task either by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) or by other types of PCR amplification but the reliable detection and interpretation of the results depend heavily on the efficiency and robustness of

separation. The universally used TBE buffer system has certain limitations, when applied for separation of complex DNA mixtures. The multiphasic buffer system (which was originally developed for separation of proteins) proved to be superior for the task to separate complex DNA fragments quickly, effectively and without loss of resolution

The multiplexing of bovine k-casein (important protein component of milk, which influences milk characteristics) and BLAD (an inheritable immunodeficiency syndrome) loci was necessary to reduce costs and labour. Successful multiplexing of k -casein and BLAD and improvement of BLAD typing has been achieved.

In our population studies (described elsewhere) there was a need to detect the C allele of ovine b-lactoglobulin encoding gene. From the protein data found I managed to “backtranslate” the DNA sequence and identify the one and only possibility for the mutation at that level.
 

Publications

1. Zsolnai A., Fésüs L.: Simultaneous analysis of bovine -casein and BLAD alleles by multiplex PCR followed by parallel digestion with two restriction enzymes. Animal Genetics 27, 207-209 (1996)
2. Zsolnai A., Fésüs L.: Enhancement of PCR-RFLP typing of bovine leukocyte adhesion deficiency. BioTechniques Vol. 23, No. 3, 380 (1997)
3. Zsolnai A., Orbán, L. : Accelerated separation of random complex DNA patterns in gels: Comparing the performance of discontinuous and continuous buffers. Electrophoresis, 20, No. 7, 1462-1468, (1999)
4. Anton, I., Zsolnai A., Fésüs, L.: Identification of the variant C of b-lactoglobulin in sheep using a PCR-RFLP method. Journal of Animal Breeding and Genetics 116 (6), 525-528 (1999)